細胞溶酶體脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞溶酶體脂酶（酸性脂酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過溶酶體脂酶反應系統中，在選擇性抑制劑存在與否的情況下，底物膽固醇油酸酯水解后的游離脂肪酸，與醋酸銅反應后的藍綠色產物，呈現吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解樣品（動物、人體、昆蟲等）溶酶體脂酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

溶酶體酸性脂酶（lysosomal acid lipase；LAL；EC3.1.1.13），又稱為酸性膽固醇酯水解酶（acid cholesteryl ester hydrolase），是脂蛋白代謝中的水解酶（hydrolase）之一，含有372氨基酸的糖蛋白，存在于除紅細胞外的所有組織細胞中的溶酶體內。在酸性環境下，通過水解膽固醇酯（cholesterol ester）和甘油三酯（triacylglycerols）鍵，以降解細胞內的脂蛋白，釋放出游離脂肪酸，調節細胞內的脂類代謝，尤其是膽固醇合成和甘油三酯代謝。溶酶體脂酶缺陷將導致伍爾曼氏病（Wolman disease）和膽固醇酯儲積病Cholesteryl Ester Storage Disease）。溶酶體脂酶具有治療動脈粥樣硬化（atherosclerosis）和外周血管性疾病的潛力。基于底物膽固醇油酸酯（cholesterol oleate），在溶酶體酸性脂酶特異性抑制劑氯丙嗪（chlorpromazine）存在與否的情況下，通過溶酶體酸性脂酶的水解催化，產生游離脂肪酸油酸（oleate），繼而與生色試劑醋酸銅反應，產生藍綠色銅鹽復合物，在分光光度儀下，其吸光值的變化（715nm 波長），來定量測定溶酶體酸性脂酶的活性。其反應系統為：

lysosomal acid lipase

cholesterol oleate  +  H2O      →      cholesterol  +  oleate

chlorpromazine（+/—）

 oleate  +  cupric acetate/pyridine      →     cupric salt

產品內容

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）    20毫升

緩沖液（Reagent C）  50毫升

底物液（Reagent D）   5毫升

稀釋液（Reagent E）    50毫升

顯色液（Reagent F）  10毫升

專性液（Reagent G）     1毫升

標準液（Reagent H）     1毫升

產品說明書      1份

保存方式

保存在4℃冰箱里，稀釋液（Reagent E）和標準液（Reagent H）具有揮發性和毒性，注意密閉瓶蓋和操作安全；有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備
• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20至40下）
• 將所有細胞勻漿物移入1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為800g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的1.5毫升離心管 
• 放進4℃微型離心機離心15分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒 
• 加入500微升緩沖液（Reagent C）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

• 測定準備
• 準備好待測樣品（例如細胞裂解樣品等），置于冰槽里
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長715nm，使用稀釋液（Reagent E）置零 
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、標準樣品配制

• 準備好4個1.5毫升離心管，標記為1至4號管
• 分別加入200微升稀釋液（Reagent E）到2至4號管
• 移取400微升標準液（Reagent H）到1號管
• 小心移取200微升1號管的標準液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取200微升2號管稀釋的標準液（Reagent H）到3號管，混勻
• 將1至4號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 標準曲線測定

• 移取900微升稀釋液（Reagent E）到2毫升離心管
• 加入100微升上述配制的標準液（Reagent H）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升藍綠色上層液相到新的比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟1至7四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數；橫座標（X軸）為標準油酸濃度（毫摩爾/升）

• 背景對照測定

• 移取800微升緩沖液（Reagent C）到2毫升離心管
• 加入100微升底物液（Reagent D）
• 加入100微升稀釋液（Reagent E）
• 渦旋震蕩60秒
• 37℃溫度下孵育30分鐘
• 移取100微升到新的2毫升離心管
• 加入1毫升稀釋液（Reagent E）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升上層液相到新的比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得背景吸光讀數

六、樣品總活性測定

• 移取800微升緩沖液（Reagent C）到2毫升離心管
• 加入100微升底物液（Reagent D）
• 加入100微升上述制備的待測樣品（50微克樣品蛋白）
• 渦旋震蕩60秒
• 37℃溫度下孵育30分鐘
• 移取100微升到新的2毫升離心管
• 加入1毫升稀釋液（Reagent E）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升藍綠色上層液相到新的比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得樣品吸光讀數
• 實際吸光讀數：樣品吸光讀數—背景吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應油酸濃度（毫摩爾/升）

• 樣品非特異活性測定

• 移取750微升緩沖液（Reagent C）到2毫升離心管
• 加入100微升底物液（Reagent D）
• 加入50微升專性液（Reagent G）
• 加入100微升上述制備的待測樣品（50微克樣品蛋白）
• 渦旋震蕩60秒
• 37℃溫度下孵育30分鐘
• 移取100微升到新的2毫升離心管
• 加入1毫升稀釋液（Reagent E）
• 加入200微升顯色液（Reagent F）
• 渦旋震蕩60秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心移取1毫升藍綠色上層液相到新的比色皿
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數
• 實際吸光讀數：樣品吸光讀數—背景吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應油酸濃度（毫摩爾/升）

• 計算樣品活性

• 樣品總活性和非特異活性計算

[根據標準曲線獲得樣品對應油酸濃度（毫摩爾/升）X 10（稀釋倍數）X 1（反應體系容量；毫升）]÷[ 0.1（樣品容量；毫升）X 30（反應時間；分鐘）]＝微摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾/毫克/分鐘

• 樣品特異活性計算

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 如果底物液（Reagent D）粘稠，加熱孵育后呈現乳白色液體，即可使用
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本讀數高于背景讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 溶酶體酸性脂酶單位活性定義為：在37℃，pH 5.0條件下，每分鐘內能夠釋放1微摩爾游離脂肪酸所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細胞脂類酶學檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感