逆轉錄PCR兩步法（RT-PCR）試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

逆轉錄PCR兩步法（RT-PCR）試劑是一種旨在通過逆轉錄酶（reverse transcriptase）的作用把RNA逆轉錄成cDNA后，采用體外擴增DNA的方法（PCR法），進行分析RNA構造的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于RNA分析、cDNA克隆、RNA表達等。尤其可用于低拷貝量的RNA樣品。產品即到即用，性能穩定，嚴格無核酶污染，操作簡便，逆轉錄效率和擴增產量皆高，重復性好。

技術背景

單鏈DNA結合蛋白（Single-Stranded DNA Binding Protein；SSB）用于改善逆轉錄酶（reverse transcriptase）的反應產物和作用效率。超能逆轉錄酶（Super reverse transcriptase）是一種DNA聚合酶，用于合成以單鏈RNA為模板的配對性DNA，并能最大限度地增加第一條鏈的cDNA的產量。RNA核酸酶抑制劑（RNAsin）具有廣譜穩定的RNA酶抑制功能，用于高質量清除RNA酶污染。  

產品內容

引導液（Reagent A）    90微升

逆轉液（Reagent B） 162微升

反應液（Reagent C） 600微升

補充液（Reagent D）      2毫升

產品說明書   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；有效保證6月

用戶自備

RNA樣品：用于逆轉錄擴增的模板

PCR引物：用于逆轉錄的啟動DNA片段

干式恒溫儀：用于逆轉錄反應的孵育

0.5毫升PCR管：用于逆轉錄和PCR反應的容器

渦旋震蕩儀：用于反應物混勻

微型臺式離心機：用于樣品操作

PCR擴增儀：用于核酸產物擴增

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的引導液（Reagent A）、逆轉液（Reagent B）、反應液（Reagent C）和補充液（Reagent D），以及用戶自備的RNA樣品和引物置入冰槽里融化；同時將干式恒溫儀分別設置到70℃和37℃。然后進行下列操作。

第一步：cDNA合成

• 分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒
• 放進微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 移出4.5微升引導液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管
• 加入8微升用戶自備的RNA樣品（5微克總RNA或0.25微克POLY A+ RNA）
• 用槍頭混勻
• 放進70℃干式恒溫儀孵育3分鐘
• 即刻放進冰槽里
• 加入8微升逆轉液（Reagent B）
• 用槍頭混勻
• 放進微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進37℃干式恒溫儀孵育60分鐘
• 即刻放進冰槽里
• 加入80微升補充液（Reagent D）稀釋，混勻
• 置入冰槽里備用或放進－20℃冰箱里保存

第二步：cDNA擴增

• 移出30微升反應液（Reagent C）到新的0.5毫升PCR管
• 加入用戶自備的引物F和R（分別總量為350納克）
• 加入2微升上述稀釋的cDNA合成物
• 最后加入補充液（Reagent D）到總量50微升，混勻
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 使用1000微升槍頭加入2滴礦物油（注意：參見注意事項6）
• 放進PCR擴增儀，PCR反應程序為：

• PCR產物置于－20℃冰箱里保存，直到進行任何后續實驗
• 進行瓊脂糖凝膠電泳分析

注意事項

• 本產品為20次操作
• 整個操作須在4℃狀態下進行
• 避免反復凍融
• 整個操作須戴手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
• 建議所有的操作用品屬于RNA專用
• 建議使用5微克總RNA樣品量；為了確保獲得滿意效果，不要低于500納克
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 根據Tm=4（G+C）+2（A+T）公式確定Tm溫度；建議使用分析軟件
• 本公司提供系列RT－PCR產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定嚴格無核酶污染
• 本產品經鑒定反應產量高