簡介

Western blot方法是生物實驗室常用的蛋白檢測方法之一，自從1979提出至今已有數十年的歷史。用于分析蛋白的表達情況。通過抗原抗體的特異性結合來檢測靶標蛋白，常用的檢測方法有化學發光法和熒光方法。熒光檢測方法由于可以進行多重檢測且信號穩定，越來越受到大家的青睞。二抗直接標記熒光基團，熒光信號強度和目標蛋白濃度成比例關系，而不依賴于酶促反應，定量更準確。NIR近紅外熒光檢測方法，印跡膜自發熒光較低，信噪比高。NIR熒光檢測能獲得高信噪比和高質量圖片主要依賴于激發強度大，精密的激光光源和專業的光學元件。

激光光源相比于LED、氙燈/鹵素燈更容易達到染料的吸收峰

在成像系統中,光源的選擇基于其激發特定染料的能力，選擇光源的標準是找到一個可以傳遞必要能量的可用激發光（實際激發熒光探針的光），同時又可最小化錯誤波長光浪費的標準。激光光源近紅外成像的最大優勢在于更接近普通染料的激發峰。

例如染料 IR Dye® 700 和Alexa Fluor® 680 在685nm處有個最大吸收峰(圖1A, 1B,和 表1).Azure Biosystems cSeries成像系統帶有660nm激光光源，而使用LED或者白光（氙燈和鹵素燈）的激發光源在630nm左右，染料激發不完全。

染料IR800和Alexa Flour在780nm有個最大吸收峰（圖1C,D和表1）。Azure Biosystems cSeries帶有785m的激光光源。而使用LED或者白光（氙燈和鹵素燈）的激發光在最大吸收峰偏左的方向，染料激發不完全。

窄光譜激光減少光泄露的產生

激光器在所選染料的激發峰內提供強大的、精確的激發。窄光譜激發相比于弱的、非特異性的LED和氙燈/鹵素燈白光光源系統可以消除光泄露和人為背景的產生（圖2）。減少圖像噪音，提高信噪比。

激光檢測在更短的時間內實現更高的靈敏度

激光光源更接NIR染料的最大吸收峰，并且提供更少的光泄露。那么是如何影響成像的呢？使用羊抗兔的 IR 700標記的抗體孵育進行梯度上樣的印跡膜。印跡膜首先使用LED成像系統曝光30s，然后使用激光成像系統曝光10s（圖3A）。即使成像時間少3倍，在印跡膜上也可以看見同樣數量的條帶。激光光源更接近染料的吸收峰，幫助用戶節省成像時間。

激光檢測具有較低的背景

評判數據的好壞信噪比是其中一部分，而并不是完全由信號強度決定。節省時間是其中一個好處，第二個好處是，較短的曝光時間有助于減少背景熒光。信噪比是通過分析每個明亮條帶的信號強度分別除以所選區域的背景強度所得到（圖3）。短的成像時間可以減少背景，提高信噪比同時具有較好的靈敏度。

總結

激光光源更接近NIR染料的最大吸收峰，激發強度大具有較少的光泄漏。成像時間短，自發熒光低，信噪比高等特點。

AzureC600成像系統是市場上唯一即可做激光近紅外、又可以做化學發光、多色熒光western blotting分析的成像系統，滿足實驗室的各種成像需求。

AzureC150和C200為基礎機型，從C200可升級至c300、c400、c500和c600機型。因此，無需要更換儀器實現UV、可見光、化學發光、多色熒光和近紅外成像的功能。

參考文獻

1.Towbin, H., Staehelin, T., & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS, 76(9), 4350–4354.

2. http://www.coherent.co.jp/document/whitepaper/bio/Lasers_vs_ LEDs_LaserAdvantage_no2_Spectral_Brightness.pdf