KASP技術經驗分享

KASP技術經驗分享

KASP技術經驗分享

重要的事情說三遍，終于可以開始實驗了,但在實驗前或實驗中乃在實驗后,根據小編多年的經驗,您可能會遇到以下問題,不用擔心,待小編為您一一解答.

1.引物設計提交序列時的注意事項有哪些？

我們要求所提交的序列長度至少為目標位點上下游各50bp。請注意序列來源，盡量保證序列準確，多態性位點BLAST結果證明為單拷貝也就是要特異。標注出不確定的序列及引物設計時需要跳過的堿基和序列，目標位點周圍其他多態性位點（最多可以有2個）用IUPAC碼標注。

2. PCR反應體系是怎樣的？

96孔板，10μL 體系，其中5μL DNA， 5μL mix, 0.14 μL引物。

384孔板，5μL體系，其中2.5μL DNA ， 2.5 μL mix, 0.07μL引物。

384 Array Tape, 1.6μL 體系，其中0.8 μL DNA, 0.8μL mix, 0.022μL 引物。

1536孔板，1ul 體系，其中1.5 μL DNA （烘干），1 μL mix, 0.014μL引物。

3. KASP技術對DNA有什么要求？ 

建議最小的DNA濃度為2.5 ng / μL。根據基因組大小，所需的DNA的量為：待測樣品基因組/3000Mb*5ng。建議設置DNA濃度梯度實驗，來確定最合適的DNA濃度。 KASP 對DNA純度的要求不高， 一般粗提的DNA即可滿足，但請盡量保證DNA濃度的一致性, 提取及溶解過程中盡量不要用到EDTA， 因為 EDTA會阻止KASP酶的作用。如有EDTA，建議將DNA稀釋一下，做一下濃度梯度實驗或加MgCl2優化。

4. 多個引物可以同時跑在同一塊板子上嗎？ 

可以，但KASP技術要求每個引物至少跑22個樣品加兩個NTC，否則可能影響分群判讀，造成較大的誤差。

5. NTC信號值很高，怎么辦？ 

NTC跑很高可能有三個原因，一是NTC被DNA樣品污染，二是循環數太多，引物 自身擴增。建議多加幾個NTC，注意污染問題，再看看。三是，引物設計問題，擴增產物中有引物二聚體存在， 建議重新設計引物。

6. 為什么需要recycling(加循環）, 什么時候需要加循環？

我們以36個循環作為標準的反應程序,由于不同的引物擴增速度及效率不同,部分引物在36個循環時并不能達到反應終點，導致熒光信號較低，分群較分散，影響數據分析。因此，當您發現在跑了36個循環時信號值較低，分群較分散但有分群趨勢，即可選擇加循環（94度--20秒，57度--60秒，3個循環）。如果NTC沒有擴增，最多可加4次循環。

7. KASP 試劑的儲存條件及建議是什么？

KASP 引物及Master mix 可在4度保存一周，建議儲存在-20度/-80度， Master mix需避光保存， 避免反復凍融（盡量凍融不要超過3次），建議事先將其分裝。保存得當，可延長KASP試劑的使用壽命至2-3年。

8. 用qPCR儀做KASP genotyping, 有哪些注意事項？ 

請確定您的qPCR儀型號，訂購合適ROX水平的Master mix。請在40度以下讀取KASP的終點熒光信號，分析數據時請注意調整XY坐標軸最大最小值相當。所有數據均建議在Autocall 后進行人工判讀。如有可能，建議樣品板中加陽性對照DNA。

9. 目標片段GC含量太高或太低有什么建議？ 

對于高GC含量片段（GC%>65%）的擴增，建議首先嘗試把標準的touch down 程序(61oC-55oC) 改成68oC-62oC。如果效果不好，再嘗試加5%-10%Master mix 體積的DMSO。關于低GC含量的片段擴增（GC%<40%），建議首先嘗試將touchdown 取消，改為兩步法。如果效果不好，再嘗試加0.63% 或1.06% Master mix 體積的MgCl2。 

10. 反應完成后的PCR板還可保存多長時間？ 

反應完成后的PCR板可在4度保存一周，熒光信號仍會比較穩定。一周之內加循環或重讀數據均可。 

更多問題的詳細解答，請訪問http://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/faqs/#.WBfzpWe7qB0