不想當廚子的大夫不是個好科學家——尼古拉斯·黃黃

中國飲食文化博大精深，《舌尖上的中國》向世界展示了我們這個完美的吃貨民族。一道成功佳肴，食材挑選有著非常嚴格的標準。在醫學基礎研究領域，實驗與做菜亦有共通之處，做飯時如果偷懶，用煮過面條的湯煮餛飩，餛飩的賣相口感觀感都大為降低。實驗也如此，一是一，二是二，必要精確審慎，更不可以偷懶，變通條件。偷工減料一時爽，數據糟糕難重復，山寨病毒雖省錢，博士延期哭成狗。

做菜最重要的便是原材料的品質，放到嘴里之前，你永遠不知道這道菜味道正不正，但新鮮優質的食材至少能提高這道菜的成功率，畢竟臭魚永遠無法煲出鮮湯。蛋白質組學研究亦如此，無污染無降解的合格樣本是找到靠譜差異蛋白的前提！本期黃博即向大家介紹定量蛋白質組學高通量篩選技術中的一道硬菜——iTRAQ聯合串聯質譜技術——的樣本選材。

iTRAQ 定量分析蛋白質的基本原理是利用iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側鏈氨基以共價鍵鏈接從而完成對肽段的標記，經過高效液相色譜分離，一級質譜和二級質譜分析，即可完成對樣本中蛋白質的定性與相對定量。理論上講iTRAQ實驗每個樣本需要的蛋白量至少300ug，然而實際上只要做過實驗的人都能應該都能理解所有實驗的成功率并非100%，特別對于iTRAQ這種流程復雜、對儀器穩定性依賴高的實驗，因此保守起見，每次實驗之前準備的蛋白量最好滿足兩次獨立實驗，此為其一。其二，是樣本準備階段，單純從實驗技術角度出發，只要能從樣本中提出蛋白即可進行iTRAQ實驗，但對于實驗的目來說，我們收集的樣本是否真的符合要求？不一定！特別是對于臨床收集的樣本。

iTRAQ的優點之一是樣本來源廣泛，幾乎所有收集的樣本都可利用該技術進行蛋白質組的篩選，不管是尋找功能蛋白質、機制的探索，還是疾病Biomarker的篩選，一網打盡，盡快將樣本轉化成研究成果，避免這些珍貴的樣本在冰箱中睡大覺。

樣本形式多種多樣，組織、細胞、血液（血清或血漿）、腦脊液、尿液、骨關節滑液……不同樣本收集方法不盡相同，需要有針對性的protocol，總體來說，需滿足以下幾條：

代表性原則：取樣的代表性關系到實驗結果是否具有科學意義，因此您應該根據實驗目的慎重選擇您的取樣方案。實驗與對照的樣本之間不能有污染，有條件時，應做到實驗組與對照組的樣本在取材時間、部位、處理條件等方面盡可能保持一致，否則可能會影響實驗結果的可信度。體液樣本需要通過分步離心（或濾膜）去除其中細胞、細胞碎片及細菌等干擾因素。另外非常重要的一點是不同樣本來源的蛋白質組是不一樣的，甚至同一組織中不同細胞之間的差異都會很大，這兩中樣本之間做定量是沒有可比性的，因此在設計實驗準備樣本的時候一定要考慮生物實驗中的單一變量原則。

準確性原則：代表性樣本的各種特征數據必須被準確記錄，并按要求（低溫、迅速）采集、制備、貯存、運輸，最終正確地按實驗設計進行實驗和數據處理。此外，詳細臨床數據（包括病理數據、預后隨訪數據等）的積累是保證數據分析結果的臨床意義的重要因素。

時效性原則：樣本質量是各類檢測實驗中影響實驗結果的關鍵因素，因此用于研究的樣本，在采集、制備、貯存、運輸過程中應盡可能地做到迅速，最大限度的縮短從樣本采集到實驗的時間。尤其要注意胰腺這類易降解樣本，以及尿液這類易受微生物污染的樣本。

低溫原則：樣本收集后，做好標記與記錄，盡快液氮速凍，然后于-80℃冰箱中保存，干冰寄送，整個過程需避免樣本反復凍融，以防止蛋白質的降解。但不要過于信賴-80°冰箱，即使冰箱的溫度波動平穩，保存其中的樣本仍然會發生緩慢降解，一般建議蛋白質組學研究的樣本不要保存超過一年，長時間保存的樣本需要經過質檢確定是否還能用。

為確保實驗的順利，強烈建議在取樣時，應同時備份，做一份，留一份，以防部分樣本降解，重新取材耽誤時間。即使樣本全部合格，備份的樣本還可以用來進行其他方面的實驗（如定量驗證，蛋白方面，生化方面的實驗等）。備份分為兩種，一種為嚴格備份，即：樣本取下后一分為二，這樣的兩份樣本基本上具備同性質。另一種為非嚴格備份，即生物學重復的樣本，這樣的備份樣本同質性要較前者差。

最后，針對于iTRAQ實驗，不同的實驗方案設計，不同的樣本收集方法，黃博都備有相應私貨，歡迎大家戳微信私聊。