腫瘤外泌體RNA通過激活肺泡上皮TLR3招募嗜中性粒細胞促進肺預轉移微環境形成
研究背景
1889年，Stephen Paget通過對大量腫瘤的解剖學研究發現，特定的腫瘤細胞總是傾向于轉移到特定的組織器官。假說認為腫瘤細胞只能在適宜的組織器官環境中才能形成轉移灶。盡管該發現意義重大，此種現象產生的原因卻直到2015年才最終得到解答。Nature雜志在2015年在線刊登了M.D. Anderson癌癥中心的Dihua Yu等的最新研究發現，研究人員以神經膠質細胞為研究對象，認為神經膠質細胞分泌的外泌體會改造轉移到腦部的腫瘤細胞，提高腫瘤細胞的抗凋亡能力。由此，人們在感嘆百年前科學家就已經提出如此重大理論的同時，也漸漸認識到外泌體在腫瘤細胞轉移過程中對預轉移微環境（pre-metastatic niche）影響的深遠意義。然而，這還遠不是研究的終點。外泌體影響腫瘤預轉移微環境的具體分子機制還依然有待探索。
2016年8月8日，國際著名腫瘤學術期刊《Cancer Cell》（IF：23.214）雜志在線刊登了我國腫瘤研究領域著名科學家，第二軍醫大學免疫學研究所所長，中國醫學科學院院長曹雪濤院士在肺癌研究中的最新研究成果，題為：Tumor Exosomal RNAs Promote Lung Pre-metastatic Niche Formation by Activating Alveolar Epithelial TLR3 to Recruit Neutrophils。該研究首次提出了腫瘤外泌體中的RNA通過激活肺泡上皮細胞（Lung epithelial cells）TLR3（Toll-like receptors）蛋白招募嗜中性粒細胞促進肺預轉移微環境形成，從而促進了腫瘤細胞的轉移。該工作也為人們進一步認識外泌體對腫瘤轉移的深遠影響提供了科學依據。
腫瘤轉移（Tumor metastasis）是腫瘤導致死亡的重要原因，包含了腫瘤細胞從原發灶到其它環境轉移的全部過程。其中每一個步驟都需要腫瘤和其所在的微環境的相互適應。原發腫瘤細胞通過促進適合細胞轉移的微環境的產生，這種微環境也被稱為預轉移微環境（pre-metastatic niche）。具體的來講，骨髓源性細胞（bone marrow-derived cells, BMDCs）受到原發性腫瘤因子的動員，誘導產生適合腫瘤轉移的預轉移微環境，幫助腫瘤細胞轉移到目的器官。其中，腫瘤細胞核目的器官之間關聯的具體分子機制還不完全為人所知。
在此，研究人員以肺癌上皮細胞的癌轉移為研究對象，通過對模式識別受體（Pattern-recognition receptors, PRRs）中研究最多的TLRs 進行基因敲除以及激活觀察其表型變化，結合已有文獻報道，從而發現外泌體在其中的重要作用。通過外泌體全轉錄組RNA測序實驗，進一步對外泌體中影響腫瘤轉移的RNA進行了進一步鑒定。最終，研究人員還成功地將已有的研究成果在臨床中得以應用。研究思路
研究結果
1. TLR3缺失抑制肺預轉移微環境形成以及癌細胞轉移
研究人員為了對TLR3，TLR4以及TLR9這些TLRs有總體的了解，對基因敲除的小鼠和野生型小鼠進行了Tlr3，Tlr4以及Tlr9的Lewis肺癌 (LLC) 或者B16/F10黑素瘤細胞接種，隨后進行表型觀察。結果發現，Tlr3小鼠相比較野生型，癌細胞擴散速度較慢，Tlr3小鼠生存時間也相比而言更加長。對微環境有關基因，如Bv8（Prok2），S100a8，S100a9以及Mmp9定量PCR檢測發現，其表達量均在Tlr3中顯著下降。
2. TLR3缺失降低嗜中性粒細胞招募至肺組織
由于BMDCs會被招募到轉移器官中形成轉移微環境。因此，研究人員還對肺的Tlr3以及野生型進行了細胞組分觀察。結果發現，野生型細胞組分與Tlr3細胞組分相差甚大。野生型細胞中，CD11b+ 骨髓細胞在預轉移的肺中顯著擴散，CD45+ CD11b+ Ly6G+ Ly6Cint 嗜中性粒細胞大量富集。Ly6G Ly6C+ 以及F4/80+ 巨噬細胞也有適度富集。與之相反，Tlr3缺失則降低嗜中性粒細胞招募至肺組織。
3. 腫瘤來源的外泌體調控肺上皮TLR3活性
在之前研究中，人們發現原發癌誘導產生系統性的微環境變化是通過外泌體介導的。為了對TLR3在調控預轉移微環境中的影響有一定的了解，研究人員對腫瘤來源的外泌體進行了進一步研究。通過對外泌體蛋白含量的檢測以及趨化因子和其它表型的觀察等，結果發現，腫瘤來源的外泌體調控肺上皮TLR3活性。
4. 外泌體通過其RNA激活TLR3
研究人員進一步對外泌體激活TLR3的分子機制進行了研究。已有研究表明，外泌體中含有大量的非編碼RNA。此外，TLR3不僅可以識別來源于病毒的dsRNA還可以識別來源于組織損害的dsRNA，研究人員抽提了腫瘤來源的外泌體來鑒定激活TLR3的調控因子。結果表明，腫瘤來源的外泌體RNA通過NF-kB以及MAPK在AT－II細胞中上調TLR3的表達，并且導致趨化因子產生以及嗜中性粒細胞招募從而產生預轉移微環境。
5. snRNA在腫瘤外泌體中座位TLR3的配體大量富集
外泌體中RNA種類豐富，為了確定和TLR3激活相關的外泌體RNA，研究人員采取了針對外泌體的small RNA以及lncRNA轉錄組測序（該工作由上海伯豪生物技術有限公司完成）。其中，腫瘤細胞RNA作為對照。有趣的是，研究人員發現外泌體RNA片段長度基本低于200bp。此外，研究人員還發現，外泌體RNA 70%由非編碼RNA組成。在Rfam數據庫已知的非編碼RNA中，tRNA與snRNA占比最大，并且在外泌體中，富集程度顯著高于腫瘤對照組。與此同時，重復序列RNA（SINE，LINE，LTR等）貢獻了絕大多數已知的非編碼RNA。其次，研究人員還對出了tRNA外其他的非編碼RNA進行了深入研究，結果進一步證實了snRNA是腫瘤來源外泌體中富集程度最高的幾個種類之一。TLR3之前被認為通過識別U1 snRNA在UV輻射的免疫應答中起作用，而在測序結果中，研究人員發現，U1 snRNA在腫瘤外泌體中富集程度超過1000倍。這些snRNA都具有類似的二級雙鏈莖環結構。
6. TLR3高表達預示肺癌預后較差
研究人員為了將該項研究結果和臨床相結合，最后又對90個肺癌患者樣本進行研究，確定TLR3表達量以及嗜中性粒細胞的滲透和腫瘤周邊組織與臨床結果的關聯。結果發現，TLR3高表達往往伴隨大量嗜中性粒細胞的滲透。同樣，TLR3高表達以及嗜中性粒細胞高滲透性與S100A8和S100A9的高表達也是相關的。TLR3的高表達最終導致了肺癌患者的高死亡率。
小結
預轉移微環境的產生對器官特異的轉移趨向性是極其重要的。研究人員使用內源的轉移模型，首次發現了肺上皮細胞TLR3通過腫瘤外泌體對嗜中性粒細胞的招募在促進肺預轉移微環境過程中的重要作用。在腫瘤外泌體中富集的snRNA在肺泡Type II上皮細胞中激活TLR3導致趨化因子分泌以及促進了嗜中性粒細胞得以被招募。在人類肺癌中，臨近的組織高表達TLR3與嗜中性粒細胞高度滲透有著極高的關聯性。兩者都可以代表著患者預后較差。因此，本項研究為腫瘤預轉移微環境形成以及器官特異性轉移提供了新的認識。
原文出處：Yanfang Liu, Yan Gu, Yanmei Han, ...,Xiaoqing Xu, Jianming Zheng,Xuetao Cao. Tumor Exosomal RNAs Promote Lung Pre-metastatic Niche Formation by Activating Alveolar Epithelial TLR3 to Recruit Neutrophils. Cancer cell.2016.
