制備細(xì)胞裂解物：

1.每100ml培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀懸于4mlPBS；

2.加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，冰上放置30min；

3.用針筒將10ml 0.2%Triton X-100強(qiáng)行注入細(xì)胞裂解物中，劇烈震動數(shù)次混勻；

4.加入DNase和RNase至終濃度5μg/ml，4℃震動溫育10min；

5.4℃ 3000g（5000r/min）離心30min；

6.上清轉(zhuǎn)移到一只新試管，加入DTT至終濃度為1mmol/L。

純化融合蛋白：

7.細(xì)胞裂解物與50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合，每100ml細(xì)胞培養(yǎng)物加2ml樹脂，于室溫下輕搖0min；

8.混合物于4℃以500g（2100r/min）離心5min，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS-PAGE；

9.沉淀中加入10倍標(biāo)準(zhǔn)體積的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻，洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白；

10.4℃以500g（2100r/min）離心5min，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS-PAGE；

11.重復(fù)步驟9和10兩次；

12.結(jié)合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫，也可用凝血酶，腸激酶或Xa因子切割，釋放靶蛋白。

    用谷胱甘肽洗脫融合蛋白：

    a. 沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min，洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白；

    b. 4℃以500g（2100r/min）離心5min，上清移至新管中；

    c. 重復(fù)步驟a和b兩次，合并3次的上清。

    蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上回收靶細(xì)胞：

    a. 在結(jié)合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶，腸激酶或Xa因子。每毫升樹脂加入50單位溶于1mlPBS的蛋白酶，顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下震蕩2-16h，用小規(guī)模實(shí)驗(yàn)確定精確時間；

    b. 4℃以500g（2100r/min）離心5min，上清移至新管中；

13.10%SDS-PAGE分析每一步（細(xì)胞抽提，洗滌和洗脫）樣品的蛋白質(zhì)組成。

谷胱甘肽瓊脂糖樹脂的處理：

1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿；

2.取部分勻漿放入15ml聚丙烯管（每100ml細(xì)菌培養(yǎng)物需要2ml勻漿）；

3.4℃以500g（2100r/min）離心5min，小心去掉上清；

4.在樹脂中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒數(shù)次，混合勻漿，4℃以500g（2100r/min）離心5min，小心去掉上清；