——藍白克隆篩選

 

在分子克隆過程中，篩選含有插入基因片段的重組質粒轉化子是一項必不可少的工作。一種稱為“藍白斑篩選”的顏色報告基因可以根據克隆顏色快速區分出重組和非重組的克隆。盡管藍白篩選提供了一個直觀的辨別重組克隆的方法，但是，在克隆挑取過程中，過多的人工操作過程存在主觀、速度慢、易出錯等問題。

 

Molecular Devices QPix400系列微生物克隆篩選系統提供了一個自動化的解決方案，尤其針對藍白克隆篩選，通過白光成像提供了準確高效的克隆轉化檢測方法。這個解決方案整合了QPix Software2.0藍白篩選模塊、QPix顏色濾片以及可調平板適配器。

本文重點描述了使用QPix420系統進行顏色克隆篩選實驗的結果，通過DNA測序進一步驗證了挑取克隆的準確性。

 

· 通過白光高效監控轉化效率

· 準確區分白色、藍色或淺藍色等顏色

·  智能化軟件選擇模塊，可以自動或自定義篩選

 

藍白克隆篩選的分子機理依賴于LacZ報告基因，非重組的克隆具有一個編碼B-半乳糖苷酶的功能LacZ基因。該酶分子聯合宿主菌體表達的互補片段，可以將培養基中的X-gal轉化為深藍色的5-溴-4-靛藍。相反，成功插入外源片段的重組質粒，LacZ基因失活，克隆顏色變為白色(Figure 1所示)。

 

 

 

 

Figure 1. 經典藍白克隆篩選流程示意圖：藍白篩選細菌克隆過程包括將外源基因片段插入到一個含有抗性和LacZ基因的質粒載體；插入位點為質粒載體上LacZ基因內部的多克隆位點；轉化感受態E.coli，菌體、載體以及培養基中的X-gal聯合作用形成藍色或白色克隆。

 

使用分子克隆方法構建重組載體克隆

作為實驗模型，人胰島素樣生長因子(IGF)基因被克隆到pUC57-Kan載體的多克隆位點(Figure 2A)。然后，將載體和基因片段(Human IGF)連接產物轉化E . coli 化學感受態(One Shot® TOP10, Life Technologies)。最后將轉化的細菌涂布到含有卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板，37度過夜培養。含有載體和插入片段或沒有插入片段的克隆，分別顯示為白色和藍色克隆(Figure 2B)。

 

 

生長好的藍白克隆平板放入可調平板適配器，然后一起放置到機器成像平臺上，平板和適配器下面為QPix顏色濾片(Figure 3A)；可調適配器上的彈性插銷，可以壓緊培養皿平板，確保成像過程中不會移位(Figure 3B)；QPix420白光下對平板成像(Figure 3C)。

 

 

自動識別藍白克隆

QPix420系統白光成像的圖片通過QPix software2.0軟件分析后，藍色(Figure 4A)或者白色(Figure 4B)克隆可以被自動識別，通過軟件內置的自動選取模塊可以分別被挑取(Figure 4C)。用戶可以通過柱狀圖調整篩選閾值以及定義不同篩選參數，如邊緣形狀、軸比、直徑及距離等，手動更改獲得最佳篩選效果。軟件選取的藍色和白色克隆， 可以通過QPix420系統內置的96挑針挑頭自動化挑取。

 

 

DNA測序驗證挑取的克隆

藍色和白色克隆的識別和挑取準確性通過DNA測序進行驗證。通過測序證明98%的挑取到的白色克隆在載體pUC57-Kan中都含有人IGF基因插入片段。此外，100%的挑取的藍色克隆都含有空的pUC57-Kan載體，沒有插入基因片段。通過上面實驗結果可以證明QPix400系列微生物克隆篩選系統能夠準確區分藍白克隆顏色，并準確挑取，是一個可靠的藍白克隆篩選方法。

藍白克隆篩選是一個通過顏色區分來快速識別是否含有插入序列重組克隆的直觀方法。Molecular Devices提供了一個自動化的藍白克隆篩選方案。QPix400微生物克隆篩選系條通過QPix software2.0友好的用戶界面配合顏色濾片，能夠在白光下即可準確區分克隆顏色。QPix400系統已經成為一個高效可靠的替代傳統人工篩選克隆的自動化平臺。