1、制備PBMC，并調(diào)整細(xì)胞濃度至107/ml。

2、在每個(gè)流式上樣管中加入100 µl準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為1x106個(gè)。

3、按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記CD4和CD25。根據(jù)說(shuō)明書和抗體管上的標(biāo)識(shí)確定抗體用量（一般來(lái)說(shuō)是20ul，可能隨批次有差異）。按個(gè)人要求設(shè)置空白管、對(duì)照管、補(bǔ)償管和樣本管。4 ℃孵育30 分鐘。 

4、用預(yù)冷PBS溶液洗滌細(xì)胞，300 -400 g離心5分鐘，去上清。

5、用3倍體積的固定/破膜稀釋液 稀釋 固定/破膜濃縮液，制成固定/破膜工作液，注意要新鮮配制，每個(gè)樣本的用量為1ml。

6、旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀釋好），并再次旋渦混勻。

7、避光4℃孵育30分鐘到60分鐘。

8、將破膜緩沖液用去離子水1:9稀釋，制成工作液。每個(gè)樣本的用量為4~5ml。

9、無(wú)需洗滌，直接加入2ml 破膜緩沖液（Permeabilization Buffer）300 -400 g離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。

10、（可選）重復(fù)第9步操作洗滌細(xì)胞。

11、加入100 ul PBS重懸細(xì)胞。

12、（封閉可選）體系中加入2%的大鼠血清2 ul，室溫避光孵育30分鐘。

13、體系加入適量的Foxp3抗體，對(duì)照管中加入適量的同型對(duì)照，具體用量參照說(shuō)明書，避光4℃孵育至少30分鐘。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出抗體的最適濃度。

14、加入2ml破膜工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。

15、重復(fù)上一步洗滌細(xì)胞。

16、用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)并分析。注：由于染色過(guò)程中使用了細(xì)胞固定和破膜，對(duì)比起活細(xì)胞在形態(tài)上會(huì)有一定變化，因此FSC/SSC圖中圈門時(shí)需要做一定調(diào)整。                 

注：以上說(shuō)明書僅供參考，具體實(shí)驗(yàn)請(qǐng)對(duì)照廠商說(shuō)明書操作。