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Western blot常用封閉液及注意事項

瀏覽次數:10826 發布日期:2014-11-22  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

在做Western blot實驗中,會用到固相載體(如NC膜,PVDF膜),在這些固相載體表面有很多洞洞,通過電轉,膠上的蛋白被轉移到膜上,蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合于表面。蛋白塞進了表面的很多洞洞里面,但是蛋白并不是連續的,而有很多空隙,抗體也是蛋白,也會被吸附在空的洞里,這樣就會有很多非特異性的信號。

封閉液中的蛋白可以與固相載體表面的空白位置結合,同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上,因為有“填補”和覆蓋“蛋白結合位點以避免一抗的非特異性結合,所以有”封閉“的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠狠牢固的結合在空白位置上,這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上,而只會跟特異性蛋白結合。

封閉液應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白,不結合靶蛋白表位,也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。

常見的封閉液:

BSA

   BSA是最常用的封閉液,成分單一適用于大多數情況。若免疫原是偶聯BSA的,BSA有很強的免疫原性,會導致產生很多針對BSA的抗體,為避免交叉反應,不能用BSA,脫脂奶粉封閉,可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。

血清

封閉血清的原理主要有兩點,第一是待測樣本有些與蛋白非特異性結合的物質,從而導致背景過高,因此可以用BSA或血清封閉掉這部分分特異性的結合,從這點看,BSA和血清沒有明顯區別。第二待測樣品中可能會有Fc受體,可以和抗體恒定區結合,與抗體特異性無關,封閉血清中有抗體,因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結合,BSA無法封閉Fc受體。

脫脂奶粉

   脫脂奶粉最大的優點是價格便宜,但由于成分相對復雜,所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會導致背景增加,此外,因為自身含有生物素,不能用于生物素標記的抗體系統。脫脂奶粉種含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留,在使用生物素-親和素系統和堿性磷酸酶標記的二抗時,也會使得高背景或本底水平增高。

聯科生物封閉液產品列表:

目錄號

產品名稱

規格

目錄價

LK-A3828

Bovine serum Abumin(BSA)

5g

80

LK-A3828-100

Bovine serum Abumin(BSA)

100g

880

LK-NDS010

Normal Donkey Serum

10ml

120

LK-MGS010

Normal Goat Serum

10ml

120

LK-NRS010

Normal Rabbit Serum

10ml

120

LK-NRS500

Normal Rat Serum

500il

80




 閱讀原文:http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014110022.html

發布者:杭州聯科生物技術股份有限公司
聯系電話:4006721600
E-mail:network@liankebio.com

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