要用AnnexinV雙染法測凋亡，又想同時標記蛋白marker，甚至還有胞內指標，可是PI和7-AAD都不能洗，怎么辦？

eBioscience的可固定細胞活力染料Fixable Viability Dye幫您完美解決

固定、破膜以及洗滌步驟不影響Fixable Viability Dye的染色，而PI、7-AAD的染色通常是放在其他抗體孵育完成后進行，不能洗滌即要上機檢測；對于胞內抗體的染色，由于經過了固定步驟，經過PI或7-AAD染色后所有的細胞都是陽性，所以他們只適合于胞膜染色的死活細胞鑒定 
   
實驗試劑
◎ Annexin V Apoptosis Detection kit (Cat. No. 88-8007, 88-8006, 88-8005, 88-8102, or 88-8008)
◎ 10X Binding buffer
◎ Annexin conjugated to APC, eFluor 450, FITC, PE or PerCP-eFluor 710
◎ Fixable Viability Dye eFluor® 660 (Cat. No. 65-0864), Fixable Viability Dye eFluor® 506 (Cat. No. 65-0866) or Fixable Viability Dye eFluor® 780 (Cat. No. 65-0865)
注意: Fixable Viability Dye eFluor® 450不推薦與AnnexinV檢測試劑盒同時使用
◎ Foxp3 Staining Buffer Set (Cat. No. 00-5523)
◎ Flow Cytometry Staining Buffer (Cat. No. 00-4222)
◎ PBS (azide- and serum/protein-free PBS) 
   
試驗方法   
1. 用蒸餾水稀釋 10X Binding Buffer 至 1X ；
2. 標記表面marker；
3. 用不含疊氮鈉及血清的PBS洗細胞兩次；
4. 在不含疊氮鈉及血清的PBS按1-10x106 cells/mL 的濃度重懸細胞；
5. 每1mL細胞中加入 1 μL of Fixable Viability Dye并立即渦旋混勻；
6. 2-8°C避光孵育30分鐘；
7. 孵育完成后，務必用含蛋白的緩沖液，如Flow Cytometry Staining Buffer洗兩次細胞；
8. 用1X Binding Buffer洗一次細胞；
9. 在1X Binding Buffer中按1-5x106 cells/mL濃度重懸細胞；
10. 100 μL細胞懸液中加入5 μL熒光標記的Annexin V；
11. 室溫避光孵育10-15分鐘；
12. 用1X Binding Buffer洗細胞一次；
13. 固定破膜，用破膜緩沖液洗細胞；
注意: 此時已經不需要保持緩沖液中的鈣離子，因為AnnexinV已經結合到細胞表面了
14. 進行胞內marker的標記；
15. 完成后上機分析。

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http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2013110007.html    

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