ClonePix結合CloneSelect Imager技術加強開發病毒特異性的雜交瘤細胞
ClonePix結合CloneSelect Imager技術加強開發
病毒特異性的雜交瘤細胞
雙鏈DNA病毒引起人類大多數疾病。皰疹病毒和腺病毒家族和乳頭瘤病毒在人體中會產生相似的癥狀。而且，由于病毒抗原基因組的保守，對于特殊病毒的血清學和蛋白診斷確認是非常復雜的。高度的蛋白同源性和血清交叉反應導致雙鏈DNA病毒物種之間區分是非常困難的。本研究的目的是發現識別最優的分泌高度特異性、無交叉反應的單克隆抗體的細胞系，用于生物治療的開發。
材料
1.ClonePix System (Molecular Devices, LLC)
2.CloneSelect Imager (Molecular Devices, LLC)
3.CloneMedia Semi-Solid Media for hybridomas/myelomas (Molecular Devices, LLC Cat #K8600/K8610)
4.CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific,Fluorescein (Molecular Devices, LLC Cat #K8220)
挽救低產量的雜交瘤細胞
傳統雜交瘤開發的方法涉及骨髓瘤細胞和抗原免疫過的宿主脾細胞的化學介導融合過程。融合的雜交瘤細胞經歷了眾所周知漫長和低效率的有限稀釋法的選擇過程，接著用ELISA方法篩選分離出有限數目的抗原特異性單克隆雜交瘤細胞。太長的時間戰線（超過30周）和大量的處理過程，使有限稀釋法產生不能準確量化活性和生產力的低滴度細胞系。
最早的雙鏈DNA 病毒特異性雜交瘤細胞系是1990s用有限稀釋方法開發的，但是篩選的雜交瘤細胞單克隆性和穩定性都不是很好。用不同的血清和培養基組分進行多年的重復培養（靜態的和旋轉的），這些克隆表現出不穩定（圖1）。而且，抗體的產率從來沒有超過3mg/L。由于在preps中能觀察的差別巨大的聚集物，使得純化的IgG的質量很難保持一致性。
通過亞克隆高滴度抗體的親本細胞系，挽回和穩定特異性的雜交瘤細胞系。ClonePix技術平臺利用半固體培養基和CloneDetect無標記檢測技術重篩了大量以前融合的雜交瘤細胞（圖2），顯示了明顯的技術優勢。
ClonePix高通量篩選方法能夠從低產的親本克隆細胞中挽回高產、穩定的細胞。
快速分離分泌抗體的高產克隆
ClonePix系統在流程效率和成本節約方面顯示了顯著改善，增加了發現稀有分泌子的概率。因此，ClonePix2技術單克隆抗體產生的時間減少到有限稀釋法的一半。
在這個過程中，首先擴增親本雜交瘤克隆的數量，然后ClonePix分析和挑選想要的克隆。配合使用FITC標記的CloneDetect 試劑，ClonePix系統成像和分析熒光強度。FITC陽性克隆根據克隆外部平均熒光強度由高到低進行排序。總之，僅僅5-6%的480-FITC的陽性克隆被挑取。相比大的、快速生長的陰性克隆（70-150個細胞）（圖3），大多數高分泌的克隆更小（40-60個細胞）。
480個高產克隆從半固體培養基挑取到5塊96孔含200‑μL 液體培養基的微孔板中，培養3天。為了客觀和定量評估細胞數，使用CloneSelect Imager系統成像96孔板中的克隆。超快的成像速度（96孔板小于90sec）能夠快速監控和評估5天克隆的生長。通過有效的利用CloneSelect Imager的成像，分離到前146個生長速度快的克隆（圖4）。
篩選和識別中試規模分析的亞克隆
用合成的具有抗體表位的多肽，對篩選到的前146生長速率的克隆進行抗原特異性分析。多肽和抗體顯示了很強的的親和性，完全符合前期研究的闡釋，因此，合成的多肽用來篩選新的，具有高抗體親和性的亞克隆。
生物素標記的多肽加載在含鏈霉素的微孔板表面，再加146個沒有稀釋的雜交瘤細胞上清液，測定IgG的結合能力。從中選取了前7個顯示了最優結合力的特殊亞克隆。
高IgG分泌亞克隆的中試規模生產
7個高價值特異的亞克隆在液體培養基規模化生產。這些克隆被擴增，一旦獲得足夠的培養基體積，5個亞克隆被冷凍用于將來的研究參考。而剩下的2個高親和/高IgG分泌克隆繼續擴增2-3周，直到完成中試生產（1升）。
挽救低產量雜交瘤細胞的工作流程
為了識別用于發展高級診斷的雙鏈DNA病毒特異抗體的亞克隆，ClonePix技術篩選480FITC陽性的雜交瘤克隆，基于半固體培養基技術和FITC標記的CloneDetect試劑。CloneSelect Imager 識別了其中146個快速生產的克隆，7個高產量的克隆被確認和目標多肽具有高度的特異性。選擇其中的2個亞克隆進行中試生產和剩余的5個作為細胞銀行。這個流程降低了雜交瘤細胞的篩選時間，最多為常規有限稀釋法篩選時間的50%，而且篩選了強健的目標克隆細胞作為其他附加的研究和生產。
單克隆的驗證和IgG分泌子的均一化
ClonePix系統再克隆和特異性確認之后，2個亞克隆擴增，重新種到具有CloneDetect試劑的半固體培養基的6孔板中。ClonePix系統成像和分析表明克隆正常的分泌了IgG，同時，通過均相均一化過程，能觀察到高產IgG的克隆（圖5）。
新雙鏈DNA病毒雜交瘤細胞亞克隆的生產能力
利用ClonePix技術重新篩選低產量的親本克隆。高產、穩定的亞克隆被挽回。Protein G純化單克隆抗體，定量總產量。相比親本克隆的歷史產量（~1mg/L），新的亞克隆細胞IgG的產量明顯地增加（17-25mg/L），圖6顯示。
結論
ClonePix技術改善了篩選時間周期和亞克隆雜交瘤細胞的質量，降低手動操作。而且，CloneMatrix Media和CloneDetect 試劑提高了分泌克隆的生長和檢測靈敏度。ClonePix的數據表明親本的低生產力源于小數目生產抗體的細胞被快速、無生產抗體能力的細胞壓制。
相比親本雜交瘤細胞的產量（05-1mg/L）， 結合CloneSelect Imager的使用，ClonePix 系統被證明是能識別高產（17-25mg/L）、高親和力雜交瘤細胞亞克隆的強有力工具。因此，該技術有助于推進雙鏈DNA病毒特異性的新治療性抗體的發展。
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