Matthew A. Lauber, Stephan M. Koza, 和 Kenneth J. Fountain

目的
展示GlycoWorks^TM工作流程的各方面優(yōu)勢，包括在方法驗證和故障排除中適用于不同SPE型式的靈活性以及所采用的人IgG對照標(biāo)準(zhǔn)品的可行性。

背景
蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)是十分有意義的翻譯后修飾，可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。生物治療藥物的糖基化作用無疑是必須進行徹底表征與監(jiān)測的結(jié)構(gòu)特征，尤其是在多聚糖圖譜的變化與療效和/或免疫原性的變化相關(guān)時。

一套用于評價糖蛋白中N-糖的常規(guī)應(yīng)用方法包括：通過PNGase F釋放出多聚糖，采用具有熒光活性的2-氨基苯甲酰胺(2-AB)進行標(biāo)記，然后采用親水作用色譜法(HILIC)進行分離，最后由熒光檢測器(FLR)進行檢測(圖1)。此工作流程中，比較復(fù)雜的是樣品制備步驟。為使此過程更加直觀，沃特世(Waters®)推出了GlycoWorks，將N-糖制備與分析所需的諸多耗材組合在一起。最值得注意的是，GlycoWorks實現(xiàn)了HILIC SPE的前/后標(biāo)記純化步驟，這對于確保方法的穩(wěn)定性而言非常重要。GlycoWorks可幫助制備出N-糖用于后續(xù)分析，并為方法確認和故障排除提供不同的SPE型式(低/高通量)以及IgG對照標(biāo)準(zhǔn)品。

以下內(nèi)容展示了GlycoWorks工作流程的兩個突出方面：適用于不同的SPE型式(單次用小柱和高通量板)，以及可用于方法確認和故障排除的人IgG對照標(biāo)準(zhǔn)品。

解決方案
從GlycoWorks對照標(biāo)準(zhǔn)品(部件號186007033)即人IgG中，通過兩種不同SPE型式以及各自使用維護手冊中提供的方案，制備出2-AB標(biāo)記的N-糖。圖2A顯示了對照標(biāo)準(zhǔn)品中多聚糖的HILIC-FLR色譜圖，實驗采用GlycoWorks HILIC μElution 96孔板(部件號186002780)、ACQUITY UPLC GST Amide (BEH Glycan)色譜柱以及用于儀器控制和數(shù)據(jù)解析的UNIFI?。借助葡萄糖單位(GU)值，與多聚糖性能測試標(biāo)準(zhǔn)品(部件號186006349)(與對照標(biāo)準(zhǔn)品一樣基于人IgG) 進行對比，對此譜圖中豐度最高的九種多聚糖進行了分配。

使用GlycoWorks HILIC 1ml 小柱(單次用)(部件號186007080)所得色譜圖如圖2B所示。兩色譜圖顯示：無論選擇何種SPE型式，都可獲得極為相似的結(jié)果。為驗證此結(jié)果，對所分配的峰進行積分，用峰面積確定上述九種多聚糖的相對豐度(圖2C)。此分析說明了使用兩種不同型式SPE所得多聚糖的相對濃度并無顯著區(qū)別。此研究中，我們還使用GlycoWorks對照標(biāo)準(zhǔn)品評估了樣品量對多聚糖圖譜的影響。圖3以對比形式給出了采用HILIC μElution板制得的多聚糖(25 μg至2.5 μg IgG)的HILIC-FLR色譜圖。2.5 μg樣品的總回收率低于平均值，很可能是由少量的非特異性表面損失造成。盡管所處理樣品量相差十倍，但鑒定出的相對豐度高度相似，相差值≤11%。其中，峰9(G2FS1)的偏差最大，處理25 μg 和2.5 μg IgG時，偏差值分別為8.5%和7.6%。

總結(jié)
GlycoWorks工作流程適用于兩種不同的SPE型式：一種適合于高通量需求(96孔μElution提取板)，另一種適用于低通量應(yīng)用(1 cc小柱)。最重要的是，結(jié)果顯示：無論選擇何種GlycoWorks SPE型式，都可獲得極為相似的多聚糖圖譜。實驗結(jié)果基于GlycoWorks工作流程分析Glycoworks對照標(biāo)準(zhǔn)品中的N-多聚糖。GlycoWorks試劑盒中包含此標(biāo)準(zhǔn)品，可用于確認分析結(jié)果的正確性，或?qū)�故障排除流程有潛在的幫助�?

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