摘 要

建立老年性癡呆模型大鼠,并觀察其學習記憶能力及基底前腦膽堿能神經元數目的變化。在成年SD大鼠左側側腦室注射免疫毒素1922IgG2saporin(2. 5μg/5μl) , 3周后行Y迷宮檢測其學習和記憶能力; 4周后處死大鼠,采用免疫組化結合圖像分析技術觀察各組大鼠基底前腦ChAT陽性神經元數目的變化。結果顯示:模型組大鼠的學習記憶能力與正常組相比明顯下降(P<0. 01);模型組基底前腦的內側隔核(MS)和斜角帶垂直部(VDB)膽堿能神經元數目分別減少至正常組的9. 70%和14.09%,與正常組相比均明顯下降(P<0. 01);學習、記憶能力與基底前腦膽堿能神經元數目密切相關。上述結果表明應用1922IgG2saporin免疫毒素能成功建立AD大鼠動物模型,該模型可用于抗癡呆藥物的篩選及藥效的評價。Alzheimer病(AD)的主要癥狀是進行性認知功能障礙和學習記憶能力損害,其發病率隨年齡的增大而增高。迄今為止,由于AD的發病機理非常復雜,故在臨床上缺乏有效的治療措施。建立一個可靠的AD動物模型是研究AD的重要環節,近年來國內外學者為探討AD的發病機理和開發有效的治療藥物,曾建立了一些AD模型,但目前還沒有一個理想的模型能夠再現該病的所有特征。腦內乙酰膽堿(ACh)能神經系統的退行性變被認為是造成AD的主要病理因素之一,本實驗應用具有選擇性免疫毒素1922IgG2saporin[124]在成年SD大鼠一側側腦室注射來建立AD動物模型,并觀察其學習記憶能力及基底前腦膽堿能神經元的變化。

 

材料與方法

 

1.  材料

乙酰膽堿轉移酶(ChAT)單克隆抗體購自Chemicon公司, Ultrasensitive SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均為MaxinBiotech Inc. 公司產品。成年雄性Sprague2Dawley(SD)大鼠24只,體重250～300g,隨機分為: (1)正常組(n=8); (2)生理鹽水組(n =8):左側側腦室注射生理鹽水溶液5 μl; (3)模型組(n=8):左側側腦室注射1922IgG2sa2porin溶液2. 5μg/ 5μl。

 

2.動物模型制作

模型組大鼠用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)行腹腔注射,動物麻醉后采用平頭顱位固定于立體定位儀上。全部器械以1%新潔而滅溶液浸泡過夜(加1%亞硝酸鈉防銹)。依次用3%碘酒、75%酒精消毒。沿顱頂正中矢狀位切開頭皮,刮除骨膜,用3%H2O2 燒灼。使顱骨發白,用消毒棉簽充分推開傷口,參照大鼠立體定位圖譜,以前囟為零點,按前囟后0. 8mm,外側1. 5mm坐標用7號針頭把顱骨鉆一孔,用10μl微量進樣器取1922IgG2saporin 2. 5 μg / 5 μl,從該孔垂直進針,針深至腹側5. 5mm,緩慢勻速推注,時間不少于5min,再留針3min。傷口消毒,縫合皮膚。生理鹽水組用同樣的方法注射5μl的生理鹽水。飼養3周后,進行Y迷宮行為檢測。4周后處死大鼠,采用免疫組化結合圖像分析技術觀察各組大鼠基底前腦ChAT陽性神經元數目的變化。

 

3.  Y迷宮行為檢測

3周后,各組大鼠在三等份輻射式迷宮箱中進行檢測,箱的每支臂頂端裝有信號燈,燈亮區為安全區,安全區的方位隨機變換。選用電壓70V電擊延時30s。訓練大鼠學會分辨安全信號燈而主動逃避電擊。在條件性回避反應建立后,每天分上、下午各給大鼠10次測試,連續訓練6d,其間10次測試中有9次以上正確為學會標準。記錄每只大鼠達到學會標準所需訓練次數為學習能力(次數越少,表示學習能力越強,反之越弱);到達學會標準24h后再進行一輪測試,正確次數為記憶能力(次數多,表示記憶力強,反之弱)。

 

4.  組織切片制作及染色

麻醉動物,經左心室2升主動脈快速連續灌注200ml生理鹽水,至肝臟顏色變白后再灌注4%多聚甲醛溶液250ml(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4),按先快后慢的原則, 60min內灌注完畢。迅速開顱取腦,置于4℃的同樣固定液中后固定約2～4h,然后將腦組織移入15%的蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4)中置4℃冰箱過夜,再入30%蔗糖溶液(0. 1mol/LPB配制, pH7. 4)4℃過夜。腦組織用恒冷箱切片機作冠狀連續切片,片厚40μm,用PBS收集切片。切片始于胼胝體交叉的起始水平,止于前連合交叉前緣,每隔3片取2片,按ABC法進行免疫組化染色。切片首先用0. 01mol/L的PBS(pH7. 2)洗5min×3次;每張切片加一滴過氧化物酶阻斷劑處理30min, PBS洗5min×3次;進而加一滴正常非免疫動物血清處理30min;吸干試劑后,每張切片再加50μl ChAT單克隆抗體溶液(1∶800),于4℃冰箱孵育過夜。此日用PBS洗5min×3次;依據上述方法,按順序分別加生物素標記的二抗和鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶,最后每張切片加新鮮配制的DAB顯色液(850ml雙蒸水加DAB試劑盒A、B、C各1滴)50μl顯色3～6min,鏡下觀察顯色滿意以后用PBS漂洗,貼片,涼干后梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

 

5.  電腦采圖及計數

每只大鼠選取隔2斜角帶復合體5個代表平面,每個平面在低倍鏡(4 ×)下選擇一側內側隔核

(MS)和斜角帶垂直部(VDB)觀察視野,再于中倍鏡(20×)下以2個視野包括MS和VDB細胞密集區,使用全自動圖像分析系統(德國KONTRONIBAS2. 0,JVCky2F30B32CCD彩色圖像攝錄輸入儀)顯示視野,通過圖像分析處理,對陽性神經元的數目、面積和周長進行定量檢測;高倍鏡下(40×)觀察神經元形態。

 

6.  統計學方法

所有實驗數據均為計量資料,用均數±標準差(�x±s)表示。用SPSS11. 0統計軟件進行統計學分析,各組資料的比較采用t檢驗,兩變量的相關性采用直線相關回歸分析。

 

結  果

1.  各組大鼠學習記憶能力的比較Y迷宮檢測各組大鼠學習、記憶能力的結果見表.經配對t檢驗顯示:模型組大鼠的學習、記憶能力明顯下降,與正常組和生理鹽水組比較均有顯

著性差異(P<0. 01)。