Sean M. McCarthy and Martin Gilar

Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

寡核苷酸合成是非常高效和高產率的過程。在固相載體上進行寡核苷酸反應的典型產率為每耦合階98～99.5%。在典型的多階寡核苷酸合成中，雜質聚集在一起，即使是一般大小的21基體寡核苷酸的總產率也達到67～90%，較長鏈的寡核苷酸的產率相應較低。研究人員通常需要使用純度高于初步合成混合物的材料。因此，用于基因敲除、基因分型和診斷目的寡核苷酸通常需要在合成后進行純化。適合實驗室規模寡核苷酸純化的經濟可行的解決方案很少，而現有的方法（比如離子交換色譜分析法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法）通常比較繁瑣和費時。在本應用說明書中，我們介紹了一種成本低、速度快的中等數量材料的純化方法，單次進樣載量高達140 nmoles，采用沃特世 ACQUITY UPLC^®系統和寡核苷酸分離技術（OST）色譜柱化學技術可達到95%以上的最終純度。所提出的純化規模與標準的寡核苷酸合成規模匹配良好（50至250 nmol）。下述方法可在15至30分鐘時間內完成寡核苷酸純化，得到高純度產品。

 

RNA寡核苷酸5' -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3'由供應商處購買，并在110 μL的0.1 M 醋酸三乙胺（TEAA)中進行復溶，得到大約2.8nmol/ μL的溶液。為防止降解，樣品是在使用前不久制備的。

 

RNA寡核苷酸通過沃特世Alliance^® HPLC生物分離系統進行純化，使用了沃特世 XBridge™ BEH OST C18 4.6 x 50mm的2.5 μm色譜柱，采用離子對反相色譜法進行分離。¹

 

液相色譜系統：沃特世 Alliance HPLC生物分離系統

色譜柱： XBridge OST BEH C18 4.6 x 50mm, 2.5 μm

柱溫： 60 ˚C

流速： 1.0mL/min

流動相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流動相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 30 – 52.5% B洗脫10.0分鐘(0.15% ACN／分鐘）

檢測： PDA，260nm

 

分離產物用沃特世 PDA檢測器在260nm處檢測。流動相A由0.1% M醋酸三乙胺（TEAA）組成，流動相B為80:200.1 MTEAA/乙腈。柱溫保持在 60℃。

 

如圖1中所示，盡管寡核苷酸合成的效率很高，在21-基體中仍存在許多失敗序列。

 

盡管色譜柱上超負荷加載了更大的質量負荷，分離度仍保持N-1, N-2... 雜質在主峰前洗脫。對21-基體寡核苷酸主峰從頂點開始進行適當的切割，就會得到極高純度的產物。

 

圖2中所示被選中的餾份收集窗表示不同的質量負荷。峰值采集后，樣品可以根據需要對等分和干燥，以便長期儲存。TEAA的揮發性使離子對緩沖組分的去除非常容易。溶劑蒸發后被純化的寡核苷酸實際上是不含鹽的。

 

純化RNA寡核苷酸的純度通過ACQUITY UPLC系統來驗證。如圖3所示，我們的純化方法有效地減少了失敗序列雜質，所產生的寡核苷酸的純度比市面上可以買到的未經純化的寡核苷酸高出許多。

 

液相色譜系統： 沃特世 ACQUITY UPLC系統

色譜柱： ACQUITY UPLC OST C18柱，

2.1 x 50mm，1.7 μm

柱溫： 60 ˚C

流速： 0.2 mL/min

流動相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流動相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 35 – 85% B洗脫10.0分鐘

(1%ACN／分鐘）

檢測： PDA，260 nm

 

本文介紹的單鏈RNA寡核苷酸的純化策略速度快，成本低，可生成高純度材料。使用OST色譜柱化學技術和Alliance HPLC系統，大量的單鏈RNA粗產物可以在短時間內成功純化，進而得到高純度（約95%）的材料；根據所收集峰面積與樣品總峰面積的比值進行估計，產率可達55%。

 

該方法對用于RNAi實驗（這類實驗中保證純度和目標的特異性至關重要）的單鏈RNA的純化極為有用。此外，由于T EAA的可揮發性，該策略可以將純化的寡核苷酸儲存，在沒有T EAA這種不必要的鹽的環境中，也可以避免其他純化手段中產生的不必要的雜質。總的來說，該策略提出了一個比目前可用方法更優越的全面純化方法。此外，在考慮樣品純化所需的時間成本、反應劑和沃特世XBridge OST色譜的壽命時，這種純化方法非常經濟。

 

[1] 寡核苷酸的UPLC分離：方法開發。沃特世應用說明書。2007: 720002383EN。

 

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