SNP檢測——HRM技術應用
HRM技術服務之SNP檢測（snp檢測的最佳方案）
單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指單個核苷酸堿基的改變，包括置換、顛換、缺失和插入，導致的核酸序列的多態性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現象，這就是SNP。SNP在人類基因組中數量較多，發生頻率較高，因此被認為是繼微衛星之后的新一代遺傳學標記。
HRM檢測SNP技術是依據在一定的溫度范圍內將PCR擴增的產物進行變性，期間實時檢測體系內熒光信號。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨特的序列，因而也就有了獨特的熔解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩定性和重復性。根據曲線準確區分野生型純合子、雜合子和突變性純合子（下圖）。
檢測SNP的方法有很多種。成本較低、通量較大的方法大都局限于已知、特定位點，如Taqman探針法。既要對已知位點分析又要查找未知位點，一般采用PCR+測序的方法，成本高、操作繁復較低。
作為新一代的遺傳掃描工具,HRM技術是一種低成本、高通量、快速，且不受位點局限的檢測方法，是SNP篩查的最佳選擇。其具有"簡、效、快、廉"等其他技術難以比擬的優勢:
簡：無需序列特異性探針,不受堿基位點局限,同時檢出已知或未知突變、SNP和甲基化位點：閉管操作，避免交叉污染。
效：最低檢測0.1%-0，01%的突變或異常甲基化檢測SNP靈敏度和特異性均為100%，。
快：1次同時不多于384個樣本，在60-90分鐘內完成檢測。
廉：簡化操作步驟、降低人工和試劑成本，費用遠少于測序、Taqman探針等方法。
HRM技術特別適用于樣本量多、檢測位點較少的SNP、突變或甲基化分析，是不同于基因芯片檢測方法（檢測位點多，樣本少）的高通量方法。同時，也是基因芯片篩選后的多個基因在更多標本中驗證的最佳方法。
附表之SNP相關研究方法：
| 研究方法 |
優點 |
缺點 |
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直接測序法 |
SNP分析的金標準，能發現已知和未知SNP位點 |
每個位點均需要經PCR擴增，然后測序，成本較高，工作量大，周期特別長，價格昂貴，不適合大樣本做疾病關聯分析，且容易交叉污染。 |
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Taqman探針法（定量PCR） |
適合已知SNP位點、位點數量少、通量高的檢測 |
價格昂貴（探針合成費用高），不能同時發現未知SNP位點 |
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非探針的普通PCR方法 |
技術簡便，價格便宜，僅適用已知SNP判斷，不能確定何種SNP，適宜少量樣本的實驗室檢測 |
費時費力，速度較慢，靈敏度差；RFLP僅能檢測有酶切位點的 SNP，無酶切位點不能檢測；上述方法都需要凝膠電泳，DNA鏈二級結構容易造成人工假相，使結果出現偏差。SSCP、DGGE花費時間長、穩定性差、靈敏度有限，難以大規模開展工作。 |
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芯片技術 |
與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化、防污染等特點 |
僅適用于全基因組SNP掃描，不適宜單個基因的SNP位點檢測，精度低，價格昂貴。 |
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Illumina 技術 |
這種方案可以幫助研究人員在得益于起始樣品量要求很低優點的同時，還能夠檢測多個感興趣的區域，從而檢出罕見的基因突變。 |
高通量SNP檢測，用于SNP在全基因組上的掃描分析，價格昂貴。 |
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MALDI-TOF MS質譜技術 |
檢測速度快，理論上能分開單個堿基變化 |
這種純物理檢測易受到樣本因素的多種干擾，精確度難以保證。這種方法適宜于已經優化的特定SNP檢測，不適宜該服務商未做過或很少做過的新SNP檢測。檢測過程需要多點質控，否則精確度很低。另外，很重要的一點是這個檢測PCR過程和質譜過程是分開的，PCR需要自己做，并不便宜。 |
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基于羅氏LightCyclerTM 480的HRM技術 |
高通量、簡單、快速、省錢、高靈敏度；閉管檢測，避免污染造成的假陽性；擴增區內已知和未知SNP都能檢測；靈敏度和精確度達到近100%；HRM分析和PCR是在同時進行，無需另外儀器，相比MS等減少了額外儀器，無疑成本更低，非特異性和精確度更好。 |
須用羅氏LightCyclerTM 480 PCR儀，或LightScannerTM等儀器 |
