BIORAD 采用 Profinity eXactTM融合標(biāo)簽表達(dá)系統(tǒng)純化無(wú)標(biāo)簽的重組蛋白

親和標(biāo)簽已成為后基因組學(xué)時(shí)代純化重組蛋白常用手段。此方法無(wú)需了解蛋白質(zhì)的生化特性或生理活性，就可通過(guò)帶標(biāo)簽的重組融合蛋白選擇性地與層析基質(zhì)上的配體結(jié)合，從而得以純化任何蛋白質(zhì)。此方法與常規(guī)的層析方法不同之處在于，針對(duì)不同的蛋白質(zhì)需要開發(fā)特定的配體和方法。采用保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能完整性的溫和條件，已成功地通過(guò)一步親和層析從粗提物中純化出了多種重組蛋白，純度達(dá) 90％以上。（Arnau et al. 2006）。

然而，對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究和治療或診斷試劑的應(yīng)用，我們期望獲得天然的無(wú)標(biāo)簽蛋白，以避免親和標(biāo)簽所帶來(lái)的潛在干擾（Arnau et al. 2006, Bucher et al. 2002）。因此需要用蛋白酶剪切純化的融合蛋白，然后再經(jīng)親和層析去除蛋白酶和切除的融合標(biāo)簽從而獲得天然純品。然而針對(duì)某些特定的融合蛋白，此剪切過(guò)程比較困難。另一體系采用內(nèi)含肽對(duì)融合蛋白進(jìn)行自我剪切從而獲得天然 N端的重組蛋白。然而，這一自我剪切過(guò)程很緩慢并大大依賴于內(nèi)含肽與目的蛋白連接處的氨基酸序列（ Waugh 2005），因此限制此方法應(yīng)用于重組蛋白的純化。 
Profinity eXact純化介質(zhì)是 Profinity eXact融合標(biāo)簽系統(tǒng)的一部分，該系統(tǒng)可在 E.coli中高表達(dá)重組蛋白并對(duì)其進(jìn)行純化。它將親和層析純化和標(biāo)簽的去除整合成一步，從而解決了親和層析純化的重組融合蛋白到獲得天然重組蛋白的技術(shù)壁壘 （ Ruan et al, 2004）。將目的蛋白的編碼序列克隆至 Profinity eXact pPAL7表達(dá)載體的 Profinity eXact標(biāo)簽的下游，從而產(chǎn)生了 N端帶有標(biāo)簽的重組蛋白（圖 1）。固定在 Profinity eXact純化介質(zhì)上的突變的絲氨酸蛋白酶選擇性地與 Profinity eXact標(biāo)簽結(jié)合（Kd< 100 pM）(Ruan et al, 2004)。通過(guò)結(jié)合后的清洗過(guò)程去除宿主細(xì)胞的雜質(zhì)，然后加入 F－或 N3－精確地誘發(fā)了親和標(biāo)簽與目的蛋白之間的酶切，從而導(dǎo)致 Profinity eXact標(biāo)簽被固定的蛋白酶滯留在介質(zhì)上，僅預(yù)期的重組蛋白從層析柱上洗脫，且無(wú)需其它處理即可將其進(jìn)行下游應(yīng)用。 
   
圖 1 Profinity eXact pPAL載體
我們利用 Profinity eXact融合標(biāo)簽系統(tǒng)純化了多種不同分子量的蛋白，并用各種參數(shù)測(cè)試了它的性能。數(shù)據(jù)顯示了該新型純化系統(tǒng)的有效性，包括選擇性的捕獲帶標(biāo)簽蛋白、親和標(biāo)簽柱上的精確剪切，及整體有效并簡(jiǎn)便的純化過(guò)程。對(duì)用 Profinity eXact純化介質(zhì)裝填的 Profinity eXact mini spin層析柱和 Bio-ScaleTM層析柱進(jìn)行柱性能評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)參數(shù)有多次純化和再生循環(huán)后介質(zhì)的穩(wěn)定性及在變性劑如尿素存在時(shí)介質(zhì)的功效。

結(jié)論
我們已利用 Profinity eXact融合標(biāo)簽系統(tǒng)純化了多種無(wú)標(biāo)簽的重組蛋白。該系統(tǒng)是目前僅有的采用通常操作手段僅一步層析過(guò)程，即可獲得完全去除標(biāo)簽的重組蛋白。通常的親和標(biāo)簽純化及去除需要條件優(yōu)化，并且很費(fèi)時(shí)，而利用 Profinity eXact系統(tǒng)制備無(wú)標(biāo)簽、N端無(wú)任何其它殘基的重組蛋白只需大約 1小時(shí)。該親和介質(zhì)較為穩(wěn)定，可多次用于目的蛋白的純化，從而節(jié)約了成本。同時(shí)，我們證實(shí)了 Profinity eXact純化介質(zhì)的結(jié)合和柱上剪切特性可在高達(dá) 4 M尿素的情況下得以實(shí)現(xiàn)。因此，該系統(tǒng)適用于純化以不溶的聚集體形式存在的重組蛋白。Profinity eXact融合標(biāo)簽系統(tǒng)的有效性和一致性將使其成為獲得高產(chǎn)率無(wú)標(biāo)簽重組蛋白的通用平臺(tái)。