隨著酶聯免疫分析技術在醫學及生物學領域的廣泛應用 , 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯免疫吸附法（ ELISA ）檢測體液中游離的細胞因子（ CK ）或抗體，但由于游離的循環抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內的抗體及 CK 的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據 ELISA 技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術（ ELISPOT ）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內外廣泛應用，對探索自身免疫系統疾病發病機制具有重要意義。

　　ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統 ELISA 法，是定量 ELISA 技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：

細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，應用德國AID的ELISPOT 酶聯斑點分析系統可以對斑點進行分析得出結果。

幾次重復實驗才能使結果更有意義？

ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當的抗原刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時后會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志，其后再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下約10-20mm大小染色的斑點。

ELISPOT是20多年前便己研發成功的老技術。Czerkinsky 等人率先在1983年，運用該技術成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術競賽，每個團隊都希望能率先將此一技術推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內實驗的環境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內免疫反應啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預測體內免疫系統即將進行的下游免疫反應。
　　ELISPOT Cytokine技術雖說操作簡單，但該技術并沒能如預期地很快地被成功應用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術從B細胞免疫走向T細胞免疫的產生的第一個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質、呈色底膜的材質等幾個技術性的問題，使當時多數研究團隊很難獲得清晰的斑點，結果是敏感度不夠、數據分析重現性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標準膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統標準薄膜（Panel B）并行實驗的比較結果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過完全相同的實驗，Panel A呈現較清晰的小色點。

　

第二個技術性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設缺乏科學實證，也使得該技術在當時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎但很重要的問題，諸如； 　　

·  實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生產，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應？

·  斑點的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？

 

·  能否相信斑點是由單一的細胞造成？ · ELISPOT Cytokine分析技術能準確測量的頻率范圍？ · 如果效應相互拮抗的cytokine同時產生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？

·  移植研究 – allograft rejection

·  疫苗開發 -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響

·  Th0/Th1/Th2細胞轉換分析

·  自體免疫研究 – 免疫調節及免疫治療研究

·  癌癥研究 -腫瘤反應T細胞作用

·  過敏機制探討 – IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉換，其它參與過敏機制之細胞激素研究

·  傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等

·  抗原決定位定圖

·  體液免疫力研究 – B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應的進展研究

圖注：ELISPOT 法在檢測低頻率產生細胞因子的細胞時具有獨一無二的敏感性。將指定數目的能產生 IFN- 的T細胞與一百萬個抗原呈現細胞（Antigen Presenting Cells，APC）混合后，使用 ELISPOT 法（上圖）、胞質內染法（中圖）和 ELISA 法（下圖）分別測量產生 IFN- 的細胞的數目。 ELISPOT 分析使單細胞分泌產物可視化。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細胞的周圍進行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細胞上的受體捕獲，或降解之前。

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