AF660馬來酰亞胺進行偶聯反應實驗的方法及步驟
XFD660 馬來酰亞胺是硫醇反應性染料，用于標記巰基。XFD660 適合成像和流式細胞術應用。在pH 4-10范圍內熒光不受影響且光穩定性好。XFD660 的馬來酰亞胺衍生物通常用于與蛋白質、寡核苷酸或低分子量配體上的硫醇基團結合，產生的結合物與其他光譜相似的熒光團相比，熒光亮度明顯更高，光穩定性更強。
馬來酰亞胺在中性條件下很容易與蛋白質、經巰基修飾的寡核苷酸和其他含巰基分子中的巰基發生反應。所得的染料偶聯物相當穩定。
AF660馬來酰亞胺適用范圍
標記抗體、蛋白質、硫醇修飾的寡核苷酸
AF660馬來酰亞胺實驗方案
溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性等分，并在配制后儲存在-20°C下。避免反復凍融。
1.蛋白質儲備溶液（溶液A）
將100µL反應緩沖液（例如pH~6.0的100mM MES緩沖液）與900µL蛋白溶液（例如抗體，蛋白質濃度>2 mg/mL）混合，制成1mL蛋白質標記儲備溶液。
注意：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為6.5±0.5。
注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白穩定的抗體不能很好地被標記
注意：蛋白質濃度低于2mg/mL，偶聯效率會顯著降低。為了獲得好的標記效率，建議結束蛋白質濃度范圍為2-10mg/mL。
2.染料儲備溶液（溶液B）
將無水DMSO加入XFD660 馬來酰亞胺小瓶中，制成10mM儲備溶液。通過移液或渦旋混合均勻。
注意：開始偶聯之前準備染料儲備溶液（溶液B）并及時使用。染料儲備溶液長時間儲存可能會降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情況下可以在冰箱中儲存4周。避免反復凍融。
3.可選
如果您的蛋白質不含游離半胱氨酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理蛋白質生成硫醇基團。 DTT 或 TCEP 將二硫鍵轉化為兩個游離硫醇基團。如果使用 DTT，則必須在馬來酰亞胺染料與蛋白質結合之前，通過透析或凝膠過濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團的示例方案：
1.在蒸餾水中制備 1M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鮮溶液。
2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT儲備液。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合（以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸）。
3.將還原的 IgG 通過用“交換緩沖液”預平衡的過濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。
4.確定蛋白質濃度并將大部分 IgG 的組分合并。可以通過分光光度法或比色法來完成。
此步驟后盡快進行綴合（參見示例實驗方案）。
注意： 為了獲得好的結果，IgG 溶液得濃度應 >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應進行濃縮。另外，需要增加 10% 來補償在緩沖液交換柱上的損失。
注意：還原反應可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進行，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。
注意：步驟3和4可以用透析代替。
樣品實驗方案
（該方案適用于山羊抗小鼠IgG與XFD 660 馬來酰亞胺的偶聯物標記。）
注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比的蛋白質偶聯物會降低靈敏度。
進行偶聯反應
1.使用10:1的摩爾比率（溶液B（染料）/A（蛋白質））作為起點：將5µL染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入蛋白質溶液（95µL溶液A）的小瓶中并充分搖晃。假設蛋白質濃度為10mg/mL，蛋白質分子量為~200KD，則蛋白質濃度為~0.05 mM。
注意：建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比為10:1。如果太少或太高，可以嘗試5:1、15:1和20:1來確定合適的染料/蛋白質比。
2.在室溫下繼續旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。
純化偶聯
（以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料蛋白偶聯物的一個例子）
1.按照產品說明準備Sephadex G-25柱。
2.將“進行偶聯反應”步驟中的反應混合物裝入Sephadex G-25柱的頂部。
3.當樣品剛低于頂部樹脂表面時，立即加入PBS（pH 7.2-7.4.）。
4.向樣品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子純化。將含有目標染料-蛋白質綴合物的組分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白質綴合物物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝。
注意：為了長期儲存，染料蛋白綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。
表征所需的染料-蛋白質綴合物
取代度 (DOS) 是表征染料標記蛋白質的關鍵因素。 DOS 較低的蛋白質通常熒光強度較弱，而 DOS 較高的蛋白質也可能熒光強度減弱。對于大多數抗體，建議DOS 在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質的特性。為了有效標記，DOS 應控制為每摩爾抗體含有 5-8 摩爾 XFD660 馬來酰亞胺。以下步驟概述了如何確定 XFD660 馬來酰亞胺標記蛋白的 DOS。
檢測吸收率
要測量染料-蛋白質綴合物的吸收光譜，請將樣品濃度保持在 1 至 10 µM 之間。該范圍內的確切濃度取決于染料的消光系數。
在 280 nm 處讀取 OD（吸光度）和染料吸光度（對于 XFD660 染料，ƛmax = 663 nm）
對于大多數分光光度計，用去離子水稀釋樣品（來自柱餾分），直到 OD 值落在 0.1 至 0.9 的范圍內。蛋白質的吸光度為 280 nm，而 XFD660 馬來酰亞胺的吸光度為 663 nm。為了確保讀數準確，請確保結合物不含任何非結合染料。
馬來酰亞胺在中性條件下很容易與蛋白質、經巰基修飾的寡核苷酸和其他含巰基分子中的巰基發生反應。所得的染料偶聯物相當穩定。
AF660馬來酰亞胺適用范圍
標記抗體、蛋白質、硫醇修飾的寡核苷酸
AF660馬來酰亞胺實驗方案
溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性等分，并在配制后儲存在-20°C下。避免反復凍融。
1.蛋白質儲備溶液（溶液A）
將100µL反應緩沖液（例如pH~6.0的100mM MES緩沖液）與900µL蛋白溶液（例如抗體，蛋白質濃度>2 mg/mL）混合，制成1mL蛋白質標記儲備溶液。
注意：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為6.5±0.5。
注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白穩定的抗體不能很好地被標記
注意：蛋白質濃度低于2mg/mL，偶聯效率會顯著降低。為了獲得好的標記效率，建議結束蛋白質濃度范圍為2-10mg/mL。
2.染料儲備溶液（溶液B）
將無水DMSO加入XFD660 馬來酰亞胺小瓶中，制成10mM儲備溶液。通過移液或渦旋混合均勻。
注意：開始偶聯之前準備染料儲備溶液（溶液B）并及時使用。染料儲備溶液長時間儲存可能會降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情況下可以在冰箱中儲存4周。避免反復凍融。
3.可選
如果您的蛋白質不含游離半胱氨酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理蛋白質生成硫醇基團。 DTT 或 TCEP 將二硫鍵轉化為兩個游離硫醇基團。如果使用 DTT，則必須在馬來酰亞胺染料與蛋白質結合之前，通過透析或凝膠過濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團的示例方案：
1.在蒸餾水中制備 1M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鮮溶液。
2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT儲備液。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合（以盡量減少半胱氨酸再氧化為胱氨酸）。
3.將還原的 IgG 通過用“交換緩沖液”預平衡的過濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。
4.確定蛋白質濃度并將大部分 IgG 的組分合并。可以通過分光光度法或比色法來完成。
此步驟后盡快進行綴合（參見示例實驗方案）。
注意： 為了獲得好的結果，IgG 溶液得濃度應 >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應進行濃縮。另外，需要增加 10% 來補償在緩沖液交換柱上的損失。
注意：還原反應可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進行，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。
注意：步驟3和4可以用透析代替。
樣品實驗方案
（該方案適用于山羊抗小鼠IgG與XFD 660 馬來酰亞胺的偶聯物標記。）
注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比的蛋白質偶聯物會降低靈敏度。
進行偶聯反應
1.使用10:1的摩爾比率（溶液B（染料）/A（蛋白質））作為起點：將5µL染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM）加入蛋白質溶液（95µL溶液A）的小瓶中并充分搖晃。假設蛋白質濃度為10mg/mL，蛋白質分子量為~200KD，則蛋白質濃度為~0.05 mM。
注意：建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比為10:1。如果太少或太高，可以嘗試5:1、15:1和20:1來確定合適的染料/蛋白質比。
2.在室溫下繼續旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。
純化偶聯
（以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料蛋白偶聯物的一個例子）
1.按照產品說明準備Sephadex G-25柱。
2.將“進行偶聯反應”步驟中的反應混合物裝入Sephadex G-25柱的頂部。
3.當樣品剛低于頂部樹脂表面時，立即加入PBS（pH 7.2-7.4.）。
4.向樣品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子純化。將含有目標染料-蛋白質綴合物的組分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白質綴合物物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝。
注意：為了長期儲存，染料蛋白綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。
表征所需的染料-蛋白質綴合物
取代度 (DOS) 是表征染料標記蛋白質的關鍵因素。 DOS 較低的蛋白質通常熒光強度較弱，而 DOS 較高的蛋白質也可能熒光強度減弱。對于大多數抗體，建議DOS 在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質的特性。為了有效標記，DOS 應控制為每摩爾抗體含有 5-8 摩爾 XFD660 馬來酰亞胺。以下步驟概述了如何確定 XFD660 馬來酰亞胺標記蛋白的 DOS。
檢測吸收率
要測量染料-蛋白質綴合物的吸收光譜，請將樣品濃度保持在 1 至 10 µM 之間。該范圍內的確切濃度取決于染料的消光系數。
在 280 nm 處讀取 OD（吸光度）和染料吸光度（對于 XFD660 染料，ƛmax = 663 nm）
對于大多數分光光度計，用去離子水稀釋樣品（來自柱餾分），直到 OD 值落在 0.1 至 0.9 的范圍內。蛋白質的吸光度為 280 nm，而 XFD660 馬來酰亞胺的吸光度為 663 nm。為了確保讀數準確，請確保結合物不含任何非結合染料。
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