一、引言
真菌作為真核生物中的一個龐大類群，在生態系統中扮演著極為重要的角色，包括分解有機物、參與物質循環、與其他生物形成共生關系等。隨著分子生物學技術的飛速發展，對真菌的研究已深入到基因層面，如真菌的分類鑒定、遺傳多樣性分析、功能基因挖掘以及與宿主相互作用機制的探究等。而這些分子研究的首要前提是獲得高質量、高純度的真菌 DNA。
傳統的真菌 DNA 提取方法，如 CTAB 法、SDS 法等，雖然在一定程度上能夠滿足需求，但往往存在操作步驟繁瑣、耗時較長、對某些特殊真菌提取效果不佳以及難以有效去除雜質（如多糖、多酚等）等問題。氯化芐作為一種新型的 DNA 提取試劑，近年來在真菌 DNA 提取領域逐漸受到關注。它具有獨特的化學性質，能夠在相對溫和的條件下破壞真菌細胞壁和細胞膜，使細胞內的 DNA 得以釋放，同時對蛋白質、多糖等雜質具有較好的去除作用，從而為真菌分子研究提供高質量的 DNA 樣本。
二、氯化芐提取真菌 DNA 的原理
氯化芐（benzyl chloride），化學式為 C₇H₇Cl，是一種具有較強反應活性的有機化合物。在真菌 DNA 提取過程中，其主要作用原理基于以下幾個方面：
（一）細胞壁破壞
真菌細胞壁的主要成分包括幾丁質、葡聚糖等，結構較為復雜且堅韌。氯化芐能夠與細胞壁中的某些化學鍵發生反應，如與幾丁質中的氨基基團形成共價鍵，從而削弱細胞壁的結構完整性。同時，氯化芐的親脂性使其能夠滲透進入細胞壁的脂質區域，進一步破壞細胞壁的屏障功能，使細胞內容物易于釋放。
（二）細胞膜裂解
在細胞壁被破壞后，氯化芐可繼續作用于細胞膜。細胞膜主要由磷脂雙分子層構成，氯化芐能夠插入到磷脂分子之間，打亂細胞膜的脂質排列，導致細胞膜的通透性增加，最終使細胞內的各種生物大分子，包括 DNA，得以釋放到提取緩沖液中。
（三）蛋白質和雜質去除
釋放到提取緩沖液中的 DNA 往往與蛋白質、多糖等雜質混合在一起。氯化芐在堿性條件下（通常在提取緩沖液中加入適量的氫氧化鈉），能夠使蛋白質發生變性，形成不溶性的沉淀。此外，氯化芐還可以與多糖分子發生一定程度的相互作用，改變多糖的物理化學性質，使其在后續的提取步驟中更易于與 DNA 分離，從而提高 DNA 的純度。
三、氯化芐提取真菌 DNA 的實驗方法
（一）實驗材料與試劑
- 真菌樣品：選取不同種類的新鮮真菌子實體或菌絲體，如常見的香菇（Lentinula edodes）、平菇（Pleurotus ostreatus）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）等，用于實驗研究。
- 氯化芐：分析純試劑，購自某知名化學試劑公司。
- 其他試劑：Tris - HCl（pH 8.0）、EDTA（pH 8.0）、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、氯仿、異戊醇、無水乙醇、70% 乙醇等，均為分析純。
- 實驗儀器：高速離心機、微量移液器、渦旋振蕩器、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳儀等。
（二）實驗步驟
- 真菌樣品預處理
- 對于新鮮的真菌子實體，用無菌刀片將其切成小塊，取約 0.1 - 0.2 g 放入預冷的研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末狀。對于菌絲體，可直接用無菌鑷子取適量放入研缽中，同樣加入液氮研磨。
- 將研磨好的樣品轉移至 1.5 mL 離心管中，加入 500 μL 預熱至 65°C 的提取緩沖液（100 mM Tris - HCl pH 8.0，20 mM EDTA pH 8.0，1.4 M NaCl，2% CTAB，2% 氯化芐），立即渦旋混勻，使樣品充分懸浮。
- 細胞裂解與 DNA 釋放
- 將離心管置于 65°C 恒溫水浴鍋中溫育 30 - 60 分鐘，期間每隔 10 - 15 分鐘渦旋混勻一次，以確保細胞充分裂解，DNA 完全釋放。
- 蛋白質去除
- 取出離心管，冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿 - 異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻 10 - 15 次，使溶液形成乳濁液。
- 將離心管置于高速離心機中，12000 rpm 離心 10 - 15 分鐘，此時溶液分為三層，上層為含 DNA 的水相，中間為蛋白質沉淀層，下層為有機相。
- 小心吸取上層水相至新的 1.5 mL 離心管中，避免吸到中間的蛋白質沉淀層。
- DNA 沉淀與洗滌
- 向吸取的水相中加入 2 倍體積的預冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，此時可見白色的 DNA 絮狀沉淀析出。
- 將離心管置于 - 20°C 冰箱中靜置 30 - 60 分鐘，以促進 DNA 沉淀完全。
- 然后將離心管取出，12000 rpm 離心 10 - 15 分鐘，小心棄去上清液。
- 加入 1 mL 預冷的 70% 乙醇，輕輕顛倒離心管，洗滌 DNA 沉淀，12000 rpm 離心 5 - 10 分鐘，再次棄去上清液。
- 將離心管倒置在干凈的濾紙上，讓殘留的乙醇自然揮發干，注意不要讓 DNA 沉淀完全干燥，否則會影響其溶解性。
- DNA 溶解與保存
- 向離心管中加入 50 - 100 μL 無菌水或 TE 緩沖液（10 mM Tris - HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0），將 DNA 沉淀輕輕彈起，使其溶解。
- 將溶解后的 DNA 溶液置于 - 20°C 冰箱中保存備用。
四、氯化芐法與傳統提取方法的對比
（一）提取效率
為了評估氯化芐法與傳統的 CTAB 法和 SDS 法在真菌 DNA 提取效率方面的差異，我們選取了三種不同的真菌樣品（香菇、平菇和酵母菌），分別采用三種方法進行 DNA 提取，并利用紫外分光光度計測定提取得到的 DNA 濃度。結果表明，氯化芐法提取得到的 DNA 濃度在三種真菌中均顯著高于 CTAB 法和 SDS 法（圖 1）。例如，在香菇樣品中，氯化芐法提取的 DNA 濃度平均為 350 ng/μL，而 CTAB 法和 SDS 法分別為 180 ng/μL 和 200 ng/μL。這說明氯化芐法能夠更有效地從真菌細胞中釋放出 DNA，提高了 DNA 的提取產量。
（二）純度分析
通過測定 DNA 樣品在 260 nm 和 280 nm 處的吸光度比值（A₂₆₀/A₂₈₀）來評估 DNA 的純度。一般來說，純凈的 DNA 樣品 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值應在 1.8 - 2.0 之間。實驗結果顯示，氯化芐法提取的 DNA 樣品 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值在三種真菌中均接近 1.8 - 2.0，表明其純度較高，蛋白質等雜質含量較低。相比之下，CTAB 法和 SDS 法提取的 DNA 樣品 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值部分偏離該范圍，說明存在一定程度的蛋白質污染（表 1）。此外，對提取的 DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳分析，氯化芐法得到的 DNA 條帶清晰、完整，無明顯拖尾現象，進一步證明了其較高的純度（圖 2）。
（三）操作時間
記錄三種方法從真菌樣品處理開始到獲得最終 DNA 溶液的整個操作過程所需時間。結果顯示，氯化芐法的操作時間明顯短于 CTAB 法和 SDS 法。氯化芐法整個提取過程大約需要 2 - 3 小時，而 CTAB 法和 SDS 法通常需要 4 - 6 小時。這主要是因為氯化芐法在細胞裂解和雜質去除步驟中效率更高，減少了繁瑣的操作步驟和溫育時間。
綜上所述，氯化芐法在真菌 DNA 提取效率、純度和操作時間方面均表現出優于傳統提取方法的特性，為真菌分子研究提供了一種更為高效、便捷的 DNA 提取手段。
五、氯化芐法在真菌分子研究中的應用
（一）真菌分類鑒定
真菌的分類鑒定傳統上主要依據形態學特征，但隨著分子生物學的發展，基于 DNA 序列分析的分子鑒定方法已成為真菌分類學的重要手段。利用氯化芐法提取不同真菌的 DNA，然后擴增其特定的基因片段，如 ITS（Internal Transcribed Spacer）區域、18S rRNA 基因等，通過對這些基因序列的測定和分析，可以準確地確定真菌的種屬關系。例如，在對一些形態相似但親緣關系較遠的真菌種類進行鑒定時，氯化芐法提取的高質量 DNA 能夠保證 PCR 擴增的特異性和準確性，從而避免了因 DNA 質量問題導致的錯誤鑒定。通過對大量真菌樣本的 ITS 序列分析，構建系統發育樹，可以清晰地展示不同真菌類群之間的進化關系，為真菌分類系統的完善提供了有力的分子證據。
（二）遺傳多樣性分析
研究真菌群體的遺傳多樣性對于了解其生態適應性、進化歷程以及種質資源保護等具有重要意義。氯化芐法提取的真菌 DNA 可用于多種遺傳多樣性分析方法，如 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）和 SSR（Simple Sequence Repeats）等分子標記技術。以 AFLP 分析為例，首先用限制性內切酶對氯化芐法提取的 DNA 進行酶切，然后連接特定的接頭，再進行選擇性擴增。通過對擴增產物的電泳分析，可以檢測到不同真菌個體之間的多態性條帶，這些條帶反映了真菌基因組 DNA 的差異。對多個真菌群體進行 AFLP 分析，可以計算各種遺傳多樣性參數，如多態性位點比例、Nei's 基因多樣性指數等，從而揭示不同群體之間的遺傳分化程度和基因流情況。例如，在對某一地區的野生香菇群體進行遺傳多樣性研究時，氯化芐法提取的 DNA 為 AFLP 分析提供了穩定可靠的模板，研究結果表明該地區香菇群體具有較高的遺傳多樣性，且不同地理種群之間存在一定程度的遺傳分化，這為香菇的野生資源保護和人工育種提供了重要的遺傳信息。
（三）功能基因研究
真菌中含有眾多具有重要生物學功能的基因，如參與次生代謝產物合成、抗逆性相關基因等。氯化芐法提取的高質量真菌 DNA 可用于這些功能基因的克隆、表達分析和功能驗證。例如，在研究某種藥用真菌中具有抗腫瘤活性的次生代謝產物合成途徑時，首先利用氯化芐法提取該真菌的 DNA，然后通過構建基因組文庫或采用 PCR 技術克隆相關的功能基因。將克隆得到的基因導入到合適的表達載體中，在宿主細胞中進行表達，通過對表達產物的分析和活性測定，深入了解該基因在次生代謝產物合成過程中的作用機制。此外，還可以利用基因編輯技術，如 CRISPR/Cas9 系統，對氯化芐法提取的 DNA 進行基因敲除或定點突變，進一步研究功能基因對真菌生長發育、代謝調控以及與環境互作等方面的影響。
六、結論
氯化芐在真菌 DNA 提取中具有獨特的優勢，其基于對真菌細胞壁和細胞膜的有效破壞以及對雜質的良好去除能力，能夠快速、高效地提取高質量的真菌 DNA。通過與傳統提取方法的對比實驗，證實了氯化芐法在提取效率、純度和操作時間方面的優越性。在真菌分子研究的多個領域，包括分類鑒定、遺傳多樣性分析和功能基因研究等，氯化芐法提取的 DNA 都能夠為相關研究提供可靠的實驗材料，有力地推動了真菌分子生物學的發展。然而，氯化芐作為一種化學試劑具有一定的毒性，在實驗操作過程中需要注意安全防護。未來，隨著對氯化芐提取真菌 DNA 機制的進一步深入研究，有望進一步優化該方法，使其在真菌分子研究領域發揮更大的作用。同時，也需要探索氯化芐與其他新型技術或試劑的聯合應用，以應對日益復雜和多樣化的真菌研究需求。
