原創：右邊 文章來源于：生信人

2017年FDA批準諾華公司的CAR-T細胞治療產品上市，為難治性B細胞急性淋巴細胞白血病的治療帶來了莫大的希望，那么CAR-T治療的原理是什么呢？

首先我們來溫習一點免疫學知識，T細胞通過表面受體TCR與細胞表面的MHC分子遞呈的抗原相結合，以識別不同的細胞。但是腫瘤細胞通過減少或者缺失MHC的表達以逃脫T細胞對其識別和殺傷作用，這稱為免疫逃逸。而CAR-T是給患者的T細胞安裝上嵌合抗原受體，也就是CAR，相當于給T細胞安裝上導航，重新賦予T細胞識別腫瘤細胞的能力。

CAR-T中的T一般指的是αβT，這又是什么意思呢？T細胞表面有T細胞受體(TCR)，可以識別和結合抗原提呈細胞呈遞的抗原，TCR由兩條多肽鏈組成（聯想一下工具鉗子），每條鏈分為可變區(V，也就是鉗子頭的前1/2)和恒定區(C，也就是鉗子頭的后1/2和鉗子把)�？勺儏^與抗原肽結合，恒定區參與信號傳導。TCR的兩條肽鏈通過二硫鍵連接，形成抗原肽結合溝槽（也就是鉗子的的連接處）。TCR的兩條肽鏈有α、β、γ、δ四種，其中α/β鏈存在于輔助性T細胞Th和細胞毒性T細胞表面，占T細胞的95%，而γ/δ鏈則存在于其他類型的T細胞表面‌，占T細胞的5%。

那么為什么CAR-T治療選擇了αβT，而不是γδT細胞呢？它們除了數量，還有什么差別呢？接下來就有請今天的主角：αβT和γδT細胞。

等會兒，在讀正文之前，我們先用通俗易懂的話來復習幾個學過的概念：

①主要組織相容性復合體MHC：它其實就是抗原識別的中介，它作為中介，是沒有對抗抗原，也就是病毒、細菌的能力的，所以它需要帶著細菌、病毒去找大佬，以殺死細菌和病毒等抗原。MHC主要分為MHC-I和MHC-II。MHC-I幾乎表達在所有有核細胞表面，如果這些細胞已經被細菌、病毒感染了，那么MHC-I就能識別到，然后帶著這個感染的細胞去找細胞毒性T細胞（CTL），從而清除被細菌病毒感染的細胞。而MHC-II主要表達在抗原提呈細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞等表面，這些細胞可不是一般的細胞，當MHC-II識別到細胞外有細菌、病毒，就帶著這些細胞去吃掉它們，再去找輔助性T細胞（Th）幫忙清除細菌和病毒。進而激活體液免疫和細胞免疫應答。

②細胞免疫和體液免疫：說回剛才的MHC，MHC-I直接帶著細菌病毒去找大佬（細胞毒性T細胞），激活的就是細胞免疫。而MHC-II是有帶著B細胞去吃掉細菌病毒，再去找大佬的（輔助性T細胞），這時候B細胞會產生抗體，那么激活的就是體液免疫，但是MHC-II也帶著巨噬細胞、樹突狀細胞去了哦，所以也激活了細胞免疫。

③先天免疫和適應性免疫：先天免疫又稱為非特異性免疫或內在免疫，是機體遇到病原體攻擊是最先站出來反擊的，積極參與先天免疫的是吞噬細胞，包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等。適應性免疫又稱特異性免疫或獲得性免疫，主要由B和T淋巴細胞負責，它們接收并清除抗原提呈細胞帶來的抗原（也就是病原體），引發體液免疫和細胞免疫。

④MHC限制性：無規矩不成方圓，免疫系統也要各司其職，不能認領別人的功勞，T細胞在清除MHC帶來的細菌病毒時，要看看是誰帶來的，如Th細胞只識別MHC-II類分子，而CTL細胞只識別MHC-I類分子，這就叫MHC限制性。

讀到這里，有意思的事情發生了，Th細胞和CTL細胞是受MHC限制的，而這兩種細胞都是αβT細胞。那么γδT細胞是不是不受MHC限制呢？那它對抗原的反應性是不是就更高了呢？那用它去清除細菌、病毒、腫瘤的效果是不是更好呢？那么為什么還要選擇αβT細胞作為CAR-T治療的對象呢？讓我們帶著問題進入正文。

一、CAR-T細胞

1、CAR-T的構建原理

目前CAR-T治療使用的T細胞指的是αβT細胞，我們首先來了解一下CAR-T構建的原理（圖1）。當T細胞遇到抗原呈遞細胞或腫瘤細胞時，T細胞受體（TCR）和CD3復合物與CD4或CD8一起識別MHC復合物呈遞的肽，然后觸發TCR信號級聯反應，導致T細胞活化（圖1A）。第一代CAR主要涉及兩部分：細胞外部分的scFv和細胞內部分的CD3ζ鏈。ScFv結構域可以識別腫瘤表面抗原，CD3ζ鏈會直接激活T細胞。第二代CAR包含一個共刺激結構域，即4-1BB或CD28信號結構域。第三代CAR具有4-1BB和CD28信號轉導結構域（圖1B）。這些結構的增加加強了細胞因子產生和響應靶標刺激的增殖，降低了CAR-T細胞的細胞毒性。FDA批準的6種CAR-T產品均采用第二代 CAR 構建體，由抗原結合結構域、鉸鏈區、跨膜區、共刺激結構域和T細胞活化結構域構成。這些產品用于治療B細胞淋巴瘤、B細胞白血病和多發性骨髓瘤（圖1C）。

圖1.CAR-T構建原理

2、CAR-T細胞治療的挑戰和攻克實體瘤的工程策略

近年來，人們投入了大量精力來改進實體瘤的CAR-T細胞療法，目前已在血液腫瘤中取得了可喜的成績。但是，雖然在實體瘤中顯示出活性跡象，但迄今為止臨床試驗的結果令人失望，沒有觀察到持續較高的持久反應率。

究其原因，治療實體瘤對 CAR-T 細胞構成了三大挑戰：腫瘤異質性、腫瘤浸潤和抑制性腫瘤微環境（TME）。腫瘤抗原有兩種類型，一種是僅在腫瘤細胞中表達的腫瘤特異性抗原 （TSA） 和也可以在正常細胞中表達的腫瘤相關抗原 （TAA）。同時，腫瘤細胞也可能在不同水平表達腫瘤抗原。要克服異質性，重點時實現多靶點靶向。研究人員設計了具有兩種不同 scFv （TanCAR） 的 CAR 或表達兩種識別不同抗原的不同 CAR （雙特異性 CAR），還探索了CAR-T 細胞的額外修飾以增強其靶向能力，使 CAR-T 細胞能夠分泌雙特異性 T 細胞接合器，后者連接腫瘤抗原和 CD3 復合物以啟動 T 細胞腫瘤殺傷。實體瘤還具有限制 CAR-T 細胞浸潤的物理屏障和細胞外基質。為了克服這一挑戰，研究人員嘗試了 CAR-T 細胞的局部遞送、工程化表達趨化因子受體的 CAR、靶向蛋白酶成纖維細胞活化蛋白 （FAP）的 CAR 或細胞外基質 （ECM）修飾的 CAR-T 或溶瘤病毒。免疫抑制性 TME 是另一個重大挑戰，包括抑制性免疫細胞浸潤、免疫抑制因子（如 TGF-β）以及化學環境改變。研究人員使用基因缺失、抗 PD-1/PD-L1 抗體或 T 細胞自分泌抗體來阻斷 PD-1 等免疫檢查點，還設計了表達細胞因子或細胞因子受體的 CAR，用 PD-1 或 TGF-β 中的激活結構域代替抑制結構域作為轉換受體，并刪除 T 細胞內負調節因子或過表達 T 細胞功能增強劑來增強CAR-T細胞抗腫瘤功能（圖2）。

圖2. CAR-T面臨的挑戰和攻克實體瘤的工程策略

3、CAR-T的副作用

盡管 CAR-T 療法在血液系統惡性腫瘤中取得了臨床成功，但仍然有危及生命的副作用，例如① CRS 和②神經毒性。

①CRS 是一種全身性疾病，在最嚴重的病例中表現為全身癥狀、發熱、低血壓和器官功能障礙，它由細胞因子的大量釋放引發，IL-1 和 IL-6、CAR-T 細胞和 TME 細胞在癌細胞識別后起著關鍵的致病作用。

②神經毒性，也稱為免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（ICANS），是一種中毒性腦病，臨床上與 CRS 的發病機制密切相關。

因此研究人員致力于開發新的CAR-免疫治療，例如CAR-γδT細胞、CAR-NK細胞、CAR-巨噬細胞等。今天我們要介紹的是CAR-γδT細胞。

二、γδT細胞的研究

γδT細胞是一種進化保守的T細胞系，它可連接先天免疫和適應性免疫，比αβT細胞亞群具有更廣泛的反應性。此外，γδT細胞不受個體主要組織相容性復合體分子的限制，“現成的”治療性γδT細胞生物庫有能力從健康供體中產生，因此γδT細胞有望用于下一代免疫療法，以覆蓋更多樣化的患者群體，并可能減少不良反應。

一、γδT細胞的優勢

相對于αβT細胞，γδT細胞因其在橋接先天免疫和適應性免疫方面的獨特作用而脫穎而出。它們靶向并殺死癌細胞，不受主要組織相容性復合體 （MHC） 分子的限制，并且許多亞群自然定位于組織并在組織內發揮作用，容易識別新抗原載量低的腫瘤，識別到癌癥表面抗原的潛在多樣性，因此對癌細胞有更廣泛的識別，包括那些缺乏 MHC I 類的細胞。γδT 細胞擅長分泌干擾素γ （IFN-γ） 和腫瘤壞死α因子 （TNF-α） 等細胞因子，它們可以通過 Fas/FasL 和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 （ADCC） 等機制直接消除腫瘤細胞，它們能夠遷移到外周組織并對靶細胞快速反應，再加上它們通過協調CD 8 +αβT細胞記憶的能力，向αβT細胞交叉遞呈肽抗原，并且它們不參與移植物抗宿主病（GvHD），使其成為現成細胞治療解決方案的理想選擇（表1）。

二、γδT細胞是天然的CAR-T細胞之選的原因

1、γδTCR在識別天然抗原方面的功能與抗體類似（抗體樣識別），但由于TCRδ V-D-J基因片段重組可以實現多樣性，因此腫瘤靶點的范圍可能更廣泛，包括以高水平表達和/或多種不同癌癥的形態改變的自身表面抗原（表2）。

表2. 直接結合的γδTCRs的配體

2、γδT細胞將抗體樣識別與顆粒酶和穿孔素的高表達相結合，促進了靶細胞溶解，而不需要攜帶FcR的輔助細胞，有一定的向αβT細胞遞呈抗原的能力，以及激活自然殺傷細胞受體（NKR）的表達，包括天然細胞毒性受體和FcR，可以補充TCRγδ介導的癌細胞識別。

三、γδ T細胞識別抗原的獨特機制

我們在免疫學課本上學到的T細胞識別抗原的機制都是抗原結合在抗原提呈細胞例如MHC的胞外段，繼而提呈并活化T細胞（其實課本中的T細胞是指αβT細胞，機制就如正文前概念①所述）。而γδ T細胞具有自己獨特的抗原識別方式，它不依賴于MHC，那它是怎么識別的呢？研究人員發現腫瘤細胞和病原體都能產生一類被稱為“磷酸抗原pAg”的脂類代謝產物，這些物質能夠激活人體外周血中最大類的γδ T細胞，也就是Vγ9Vδ2 T細胞（人血液中的γδT細胞大多使用Vδ2鏈，它通常與Vγ9鏈配對。Vγ9Vδ2 T細胞占外周血γδ T細胞的50-95%）。

具有胞內和胞外結構域的跨膜乳糜蛋白BTN3A充當了磷酸抗原的遞呈分子，晶體學證據表明磷酸抗原與BTN3A1的細胞內B30.2結構域結合后，形成了與BTN2A1直接結合的復合界面，形成了以磷酸抗原分子為中心，周圍以不同的親和力粘合BTN3A的結構。從而觸發細胞外構象變化，使靶細胞能夠被Vγ9Vδ2 T細胞識別并啟動T細胞免疫，進而殺滅病原和腫瘤細胞。這種“由內而外”的信號傳導模式幫助磷酸抗原激活了γδ T細胞（圖3）。羥甲基丁二烯基焦磷酸（HMBPP）是一種外源性磷酸抗原，異戊烯二磷酸（DMAPP）和異戊二烯二磷酸（IPP）在腫瘤細胞發生發展過程中積聚。HMBPP激活Vγ9Vδ2 T細胞的能力比后兩種強很多。

圖3.化學探針方法支持不對稱二聚體構型參與 Vγ9Vδ2 T 細胞活化

三、“現成“的療法

為什么說是“現成”的呢？這是因為γδT細胞不受MHC限制，因此它們可以作為同種移植物進行輸血，幾乎沒有發生移植物抗宿主�。℅VAR）的危險，而GVAR會混淆同種異基因αβT細胞療法。因此γδ過繼細胞療法（ACT）可以提前從健康捐贈者中準備好并現貨給藥。

研究人員成功利用了γδT細胞識別抗原的獨特機制設計免疫治療藥物，開發了人類γδT細胞功能的小分子激活劑和抑制劑。例如，在中國濟南復大腫瘤醫院進行的同種異體Vγ9Vδ2 T細胞的I期試驗中，安全性得到證實，18名接受5次或5次以上輸注的晚期肝癌或肺癌患者的生存期大大延長（NCT03183206，NCT03183219，NCT03183232，NCT03180437）。由于Vγ9Vδ2 T細胞數量有限，Vγ9Vδ2 T細胞激活與αβT細胞激動相比不太可能引起不良事件。基于BTN3A分子在Vγ9Vδ2 T細胞活化中的作用，ImCheck Therapeutics （Marseille, France）開發了BTN3A特異性激動劑抗體，替代磷酸抗原驅動TCR活化。有證據表明，在用Vγ9Vδ2 T細胞重建的異種移植物模型中有腫瘤抑制作用，一種抗體（ICT0）已經在血液腫瘤和實體瘤的I/IIa期臨床試驗中，也取得了不錯的結果（NCT04243499，NCT05307874）。更具有突破性的是，用αβT細胞轉導的CAR-Vγ9Vδ2 T細胞已作為針對多發性骨髓瘤的ACT應用于I期研究（NCT04688853）。表3顯示了正在進行的γδT細胞治療癌癥的臨床試驗（包括血液腫瘤和實體瘤）。

表3. 正在進行的基于γδT細胞的癌癥臨床試驗

四、基于γδT細胞的免疫療法的挑戰

由于γδT細胞在外周血中較少，只占T細胞的5%，體外擴增比較困難，而且目前尚沒有成熟的方法去解決這個問題。但是有研究發現，使用唑來膦酸和白介素-2 (IL-2)對膠質母細胞瘤(GBM)患者的Vγ9Vδ2 T細胞進行擴增，隨后用甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)基因轉導細胞，該基因賦予對替莫唑胺(TMZ)的抗性，替莫唑胺是GBM的標準化療，其通過引起基因組損傷，可誘導Vγ9Vδ2 T細胞的TCR和NKR抗原。MGMT轉導的Vγ9Vδ2 T細胞通過用于TMZ遞送的Rickham導管在殘余腫瘤部位附近給藥。用于Vγ9Vδ2 T細胞制備和維持的改進方法提供了不斷的局部施用細胞的機會。該方法已成功應用于四種原發性和難治性GBM的人-鼠異種移植模型，并已投入臨床應用（表3）。

目前基于γδT細胞的免疫療法仍需要進一步優化，根據γδT細胞的特點、識別抗原的獨特方式來構建適合的CAR分子，并且相關的研究仍然較少，仍需要投入大量的精力從血液系統腫瘤和實體瘤、CAR-NK細胞、CAR-巨噬細胞等進行研究。