動物活體成像之生物發光實驗技巧及注意事項
通過上期的介紹，我們已經知道，生物發光和熒光作為最常見兩種光學成像技術，各有特點。其中生物發光技術因其背景噪音低，靈敏度高等優點，在腫瘤，分子互作及信號傳導等研究中得到了廣泛應用。當兩種方法都適用于研究對象時，更推薦用生物發光標記方法開展成像實驗。
一個完整的生物發光實驗流程，至少應包括實驗設計（選擇合適的熒光素酶報告基因和熒光素底物）、細胞培養與轉染（將熒光素酶報告基因轉染至細胞中，使其表達熒光素酶）、動物模型準備（選擇適當的動物模型，并根據需要進行基因編輯或誘導特定病理狀態）、細胞注射或移植（將標記細胞注射或移植到動物模型中）、熒光素底物注射（在成像前向動物注射底物，可通過腹腔注射、靜脈注射或口服等方式）、成像觀察（使用高靈敏度的活體成像系統，在預定的時間點捕捉生物發光信號）等。
本期，我們將深入探討生物發光活體成像系統的實驗技巧，從熒光素的選擇到實驗結果的分析，逐一探討生物發光實驗的注意事項及技巧。
熒光素的選擇
熒光素酶與熒光素的化學反應是生物發光的基礎，選擇合適的發光酶和底物是實驗成功的第一步。生物發光活體成像系統常用的發光酶包括螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶等。實驗一般選用螢火蟲螢光素酶，有時也會用海腎螢光素酶。
二者區別如下表所示：
體外驗證
將構建的細胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分鐘后使用IVScope小動物活體成像系統觀測，然后進行生物發光的定量分析。
計算單個細胞單位時間發出的光子數，當數值大于100時，適合進行體內實驗，數值過低或過高，都不適合體內成像或長期觀測。將定量數據繪制標準曲線，計算標準差，線性好證明細胞表達穩定，線性差則表明熒光素酶表達不穩定，同樣不適合進行體內實驗。
細胞接種
確保細胞是在良好的生長狀態下，并且已經穩定轉染或轉錄了熒光素酶基因。在接種前，使用細胞計數器或自動細胞計數儀對細胞進行準確計數。接種部位和數量應根據實驗需求進行調整，將細胞接種到實驗動物體內。確保細胞在體內生長、擴散，以產生穩定的發光信號。
熒光素底物注射
將螢光素或其它底物注射入實驗動物體內。實驗總結出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。注射方式有靜脈注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射擴散較慢，持續發光長。
靜脈注射（i.v.）：血液運輸，靈敏度高，重復性好。信號來的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：適合于肺部成像
根據實驗目的和動物模型的特點，選擇合適的注射方式。注射時，需注意注射速度、劑量和濃度，以確保發光信號在體內均勻分布。
體內預實驗確定最佳成像條件
在正式實驗前，進行預實驗以確定發光時間線和最佳拍攝時間。一般情況下，腹腔注射底物約一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發光，十分鐘后強度達到最高。在最高點持續約20-30分鐘后開始衰落，約三小時后發光全部消失。所以最好的檢測時間是在注射后15-35分鐘內。
成像設備的選擇
在生物發光實驗中，合適的儀器對確保實驗結果的準確性和可靠性至關重要。
理想的成像儀器應具備以下特點：
1. 高靈敏度
選擇具有高靈敏度的儀器，以便檢測低水平的信號，這對于早期疾病檢測和微小變化的監測至關重要。
2. 高分辨率
考慮儀器的動態范圍和分辨率，高分辨率儀器能夠提供更清晰的圖像，有助于更精確地定位和量化生物學過程。
3. 寬動態范圍
儀器應具有寬廣的動態范圍，能夠同時檢測到從低到高的信號強度。以保證在不同條件下都能獲得清晰的信號和高質量的圖像。儀器的背景噪聲應盡可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、環境適應性及樣本兼容性
選擇用戶界面友好、易于操作的設備，且能夠適應不同的實驗條件和樣本類型。考慮儀器與其他實驗設備的兼容性，以及未來升級或添加新功能的潛力。
5. 良好的技術支持和服務
確保在遇到操作或技術問題時能夠得到及時有效的幫助。綜合這些因素，選擇適合的生物發光實驗儀器，將有助于提高實驗的成功率和數據的質量。
實驗結果判讀和分析
獲取高質量的成像數據只是研究的一部分，結果的判讀與數據分析同樣重要。它能幫助研究人員從圖像中提取有價值的信息，并得出科學結論。
1. 圖像優化處理：采用軟件對拍攝到的圖像進行優化處理、灰度調節、偽彩色處理等，以提高圖像質量。
2. 定義感興趣區域（ROI）：計算發光強度、發光面積、發光信號變化等參數，分析實驗結果。可使用統計學方法對數據進行處理，以得出有意義的結論。
3. 多圖分析：不同時間點成像結果的分析要用到多圖分析，數據歸一化有助于消除偏差，批量ROI圈選及計算，生成動力學曲線、批量導出圖片及動態展示等提高了結果的可讀性和理解性。
結論
綜上所述，生物發光活體成像在實驗過程中涉及多個環節，掌握各個方面的技巧和方法對于獲得可靠、準確的實驗結果至關重要。
一個完整的生物發光實驗流程，至少應包括實驗設計（選擇合適的熒光素酶報告基因和熒光素底物）、細胞培養與轉染（將熒光素酶報告基因轉染至細胞中，使其表達熒光素酶）、動物模型準備（選擇適當的動物模型，并根據需要進行基因編輯或誘導特定病理狀態）、細胞注射或移植（將標記細胞注射或移植到動物模型中）、熒光素底物注射（在成像前向動物注射底物，可通過腹腔注射、靜脈注射或口服等方式）、成像觀察（使用高靈敏度的活體成像系統，在預定的時間點捕捉生物發光信號）等。
本期，我們將深入探討生物發光活體成像系統的實驗技巧，從熒光素的選擇到實驗結果的分析，逐一探討生物發光實驗的注意事項及技巧。
熒光素的選擇
熒光素酶與熒光素的化學反應是生物發光的基礎，選擇合適的發光酶和底物是實驗成功的第一步。生物發光活體成像系統常用的發光酶包括螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶等。實驗一般選用螢火蟲螢光素酶，有時也會用海腎螢光素酶。
二者區別如下表所示：
體外驗證
將構建的細胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分鐘后使用IVScope小動物活體成像系統觀測，然后進行生物發光的定量分析。
計算單個細胞單位時間發出的光子數，當數值大于100時，適合進行體內實驗，數值過低或過高，都不適合體內成像或長期觀測。將定量數據繪制標準曲線，計算標準差，線性好證明細胞表達穩定，線性差則表明熒光素酶表達不穩定，同樣不適合進行體內實驗。
細胞接種
確保細胞是在良好的生長狀態下，并且已經穩定轉染或轉錄了熒光素酶基因。在接種前，使用細胞計數器或自動細胞計數儀對細胞進行準確計數。接種部位和數量應根據實驗需求進行調整，將細胞接種到實驗動物體內。確保細胞在體內生長、擴散，以產生穩定的發光信號。
熒光素底物注射
將螢光素或其它底物注射入實驗動物體內。實驗總結出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。注射方式有靜脈注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射擴散較慢，持續發光長。
靜脈注射（i.v.）：血液運輸，靈敏度高，重復性好。信號來的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：適合于肺部成像
根據實驗目的和動物模型的特點，選擇合適的注射方式。注射時，需注意注射速度、劑量和濃度，以確保發光信號在體內均勻分布。
體內預實驗確定最佳成像條件
在正式實驗前，進行預實驗以確定發光時間線和最佳拍攝時間。一般情況下，腹腔注射底物約一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發光，十分鐘后強度達到最高。在最高點持續約20-30分鐘后開始衰落，約三小時后發光全部消失。所以最好的檢測時間是在注射后15-35分鐘內。
麻醉方法
為減少實驗動物在成像過程中的運動干擾，需對其進行麻醉。選擇合適的麻醉藥物和劑量，確保動物在成像過程中處于穩定狀態，保證獲得的實驗數據準確可靠，又能最大限度地保障動物福利，確保其安全。實驗動物一般較難合作，因此實驗中常采用全身麻醉，根據麻醉方式分為吸入麻醉和非吸入麻醉。
為減少實驗動物在成像過程中的運動干擾，需對其進行麻醉。選擇合適的麻醉藥物和劑量，確保動物在成像過程中處于穩定狀態，保證獲得的實驗數據準確可靠，又能最大限度地保障動物福利，確保其安全。實驗動物一般較難合作，因此實驗中常采用全身麻醉，根據麻醉方式分為吸入麻醉和非吸入麻醉。
生物發光實驗可以在底物注射后再進行麻醉。
吸入麻醉與注射麻醉的區別如下表：
在生物發光實驗中，合適的儀器對確保實驗結果的準確性和可靠性至關重要。
理想的成像儀器應具備以下特點：
1. 高靈敏度
選擇具有高靈敏度的儀器，以便檢測低水平的信號，這對于早期疾病檢測和微小變化的監測至關重要。
2. 高分辨率
考慮儀器的動態范圍和分辨率，高分辨率儀器能夠提供更清晰的圖像，有助于更精確地定位和量化生物學過程。
3. 寬動態范圍
儀器應具有寬廣的動態范圍，能夠同時檢測到從低到高的信號強度。以保證在不同條件下都能獲得清晰的信號和高質量的圖像。儀器的背景噪聲應盡可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、環境適應性及樣本兼容性
選擇用戶界面友好、易于操作的設備，且能夠適應不同的實驗條件和樣本類型。考慮儀器與其他實驗設備的兼容性，以及未來升級或添加新功能的潛力。
5. 良好的技術支持和服務
確保在遇到操作或技術問題時能夠得到及時有效的幫助。綜合這些因素，選擇適合的生物發光實驗儀器，將有助于提高實驗的成功率和數據的質量。
實驗結果判讀和分析
獲取高質量的成像數據只是研究的一部分，結果的判讀與數據分析同樣重要。它能幫助研究人員從圖像中提取有價值的信息，并得出科學結論。
1. 圖像優化處理：采用軟件對拍攝到的圖像進行優化處理、灰度調節、偽彩色處理等，以提高圖像質量。
2. 定義感興趣區域（ROI）：計算發光強度、發光面積、發光信號變化等參數，分析實驗結果。可使用統計學方法對數據進行處理，以得出有意義的結論。
3. 多圖分析：不同時間點成像結果的分析要用到多圖分析，數據歸一化有助于消除偏差，批量ROI圈選及計算，生成動力學曲線、批量導出圖片及動態展示等提高了結果的可讀性和理解性。
結論
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