細(xì)胞螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)受多種因素影響，例如載體狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染量，轉(zhuǎn)染效率，裂解效率，加樣精度等等，因此實(shí)驗(yàn)中一般需要做3個(gè)或以上復(fù)孔，且最好采用雙螢光素酶報(bào)告基因，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。現(xiàn)將雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中常見的問(wèn)題匯總?cè)缦拢?br />  

Q1:如何選擇載體？

螢火蟲螢光素酶一般選取pGL-3、pGL-4或pmirGLO的載體，也可自己構(gòu)建相應(yīng)的載體；

海腎螢光素酶一般選取phRL-TK或pGL-4載體，建議不使用強(qiáng)啟動(dòng)子（如SV40，CMV），而選取中等強(qiáng)度的啟動(dòng)子
 

Q2:檢測(cè)結(jié)果螢光值過(guò)低或無(wú)螢光值怎么辦？

多種情況均可導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果螢光值過(guò)低或無(wú)螢光，具體原因和解決辦法如下：

1,啟動(dòng)子活性低

a.優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)條件，提高螢光素酶的表達(dá)量；

b.更換強(qiáng)啟動(dòng)子（如SV40、CMV）。

2,轉(zhuǎn)染效率低

a.優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件，用較易轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照（如轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)螢光蛋白質(zhì)粒）；

b.確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過(guò)酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定；

c.選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3,樣品裂解效率低

a.細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，12-36h內(nèi)最好，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，細(xì)胞可能會(huì)難裂解；

b.加入的裂解液需足量，保證細(xì)胞能夠充分裂解。

4,檢測(cè)過(guò)程操作不規(guī)范

a. 選擇合適的檢測(cè)儀器，如Luminometer 發(fā)光計(jì)、多功能酶標(biāo)儀或者其他能夠檢測(cè)生物發(fā)光的儀器都適用于該實(shí)驗(yàn)；

b.需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)很大偏差；

c.保證室溫反應(yīng)。酶促反應(yīng)對(duì)溫度較為敏感，反應(yīng)時(shí)各個(gè)組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫（20-25℃）再使用；

d.螢光素酶的體外半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測(cè)，盡量在30min內(nèi)完成；

e. 檢測(cè)板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標(biāo)板。黑色酶標(biāo)板也可用，但因黑色會(huì)吸收光信號(hào)，可能會(huì)降低信號(hào)。

5,底物氧化失效

a.底物避光密封保存，螢火蟲螢光素酶底物-20℃保存；海腎螢光素酶底物推薦-80℃保存；

b. 反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

Q3:如何判斷轉(zhuǎn)染成功？

1，如轉(zhuǎn)入的miRNA帶螢光標(biāo)記如GFP，則可直接在轉(zhuǎn)染后、細(xì)胞裂解前，顯微鏡下觀察細(xì)胞螢光；

2，如轉(zhuǎn)入的miRNA不帶任何螢光標(biāo)記，可考慮進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)組2、4、6是否相對(duì)其對(duì)照組miRNA有顯著過(guò)表達(dá)；

3，設(shè)置一個(gè)螢光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照組，同批轉(zhuǎn)染一個(gè)組的細(xì)胞，間接反映出同批次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染情況。

Q4:細(xì)胞裂解物可以存放多久？

常溫一般不超過(guò)6小時(shí)，-20℃可以保存一個(gè)月，-80℃可以保存半年。

Q5:螢光素酶作為報(bào)告基因相比于螢光蛋白有哪些優(yōu)勢(shì)？

螢光素酶的靈敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同時(shí)具有更寬的動(dòng)態(tài)范圍，便于數(shù)值分析比較，不需要螢光顯微鏡，而且在活體實(shí)驗(yàn)中其螢光穿透性高于GFP等螢光蛋白，同時(shí)由于沒(méi)有內(nèi)源活性、其本底信號(hào)很低。而GFP等螢光蛋白相比于螢光素酶的優(yōu)勢(shì)在于可以進(jìn)行示蹤定位，并且其觀測(cè)不需裂解細(xì)胞，方便進(jìn)行適時(shí)觀察。

Q6:為什么我的實(shí)驗(yàn)復(fù)孔無(wú)法重復(fù)？

實(shí)驗(yàn)復(fù)孔有一定差異是正常的，通常只要在一個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)即可。如果差異超出這個(gè)范圍，則需要考慮以下2個(gè)方面，一是細(xì)胞裂解后離心取上清，保證樣本均一性；二是保證加樣的準(zhǔn)確性，移液器要定期校準(zhǔn)，確保移液精準(zhǔn)。

Q7:檢測(cè)結(jié)果螢光值越高越好么？

螢光值過(guò)高可能會(huì)超出儀器檢測(cè)范圍從而檢測(cè)不到結(jié)果，一般讀數(shù)在5-6之間較好，螢光值過(guò)高可通過(guò)減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測(cè)，不建議通過(guò)減少螢光底物來(lái)降低螢光值，因?yàn)榈孜镲柡筒拍芊从澄灩馑孛刚鎸?shí)的表達(dá)水平，否則會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

螢光素酶實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用

螢光素酶作為報(bào)告基因技術(shù)的一種，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，常應(yīng)用于以下幾種生物學(xué)研究：

1，啟動(dòng)子活性分析：?jiǎn)��?dòng)子區(qū)是RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)，啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)直接關(guān)系到轉(zhuǎn)錄的效率，螢光素酶實(shí)驗(yàn)可用于驗(yàn)證待測(cè)啟動(dòng)子是否有活性及其活性區(qū)域；也可實(shí)現(xiàn)組織特異性啟動(dòng)子篩選及確定；以及用于新順式作用元件發(fā)現(xiàn)及功能鑒定。

2，啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合驗(yàn)證：將待檢測(cè)的啟動(dòng)子序列構(gòu)建在報(bào)告基因上游，同時(shí)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，分析螢光素酶表達(dá)水平，即反映轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子能增強(qiáng)或抑制啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力。

3，驗(yàn)證microRNA與靶基因是否存在調(diào)控關(guān)系：microRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用，microRNA大部分通過(guò)成熟體種子區(qū)與3’UTR結(jié)合抑制蛋白翻譯。可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至報(bào)告基因luciferase的下游，再共轉(zhuǎn)入microRNA，如果螢光素酶表達(dá)下降，可以說(shuō)明microRNA對(duì)目的基因的抑制作用；

4，啟動(dòng)子SNP分析：?jiǎn)蝹�(gè)核苷酸變異，簡(jiǎn)稱SNP，通過(guò)構(gòu)建螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究SNP位點(diǎn)的增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子是否結(jié)合最為直接。

5，分析信號(hào)通路是否激活：將待檢測(cè)信號(hào)通路的下游相應(yīng)元件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，檢測(cè)不同上游條件下，其螢光素酶活性，即下游信號(hào)通路的響應(yīng)情況。