InnoScan在環境藍細菌高通量檢測微陣列芯片的應用
InnoScan文獻快訊—
環境藍細菌高通量檢測微陣列芯片
摘要：環境藍細菌因其在生態系統中的關鍵作用而備受關注。 中國研究團隊近期開發了一種名為 CyanoStrainChip 的新型DNA 微陣列芯片，可對環境藍細菌進行菌株水平的全面分析。 通過 43,666個全基因組、菌株特異性探針涵蓋幾乎所有藍細菌主要類群。 使用CyanoStrainChip無需培養藍細菌，與傳統方法相比成本更低，計算要求更低，定量效果更好。
藍細菌代表一個廣泛而普遍存在的光合自養原核生物門，以其非凡的遺傳多樣性而聞名。這些微生物存在于幾乎所有環境中，并在生態系統中發揮關鍵作用，不僅是地球大氣氧氣的重要貢獻者，還是次生代謝產物的多產者。在某些情況下，藍細菌會導致有害的水華，釋放毒素進入淡水和海洋環境，對生態系統結構和功能，以及用于娛樂、飲用水、漁業和人類健康的水質構成嚴重威脅。事實上，在各種生態系統中對藍細菌多樣性和豐度進行分析將對生態研究和有害藻華監測、評估和管理至關重要。
然而，當前研究普遍忽視了藍細菌種內多樣性，導致在種或以上的概括性結論，并未考慮菌株差異的可能性。許多屬于同一藍細菌屬（或種）的多個分離株比較研究，如 Raphidiopsis、Planktothrix 和 Microcystis，證明它們在形態、生理、毒素和遺傳學方面存在相當大的種內多樣性。但是目前環境藍細菌的高通量檢測方法很難達到菌株水平。基于聚合酶鏈反應 (PCR) 的靶向標記基因DNA 測序是克服藍細菌多樣性評估中表型表征局限性，最廣泛使用的技術。早在1997年，就開發出了一組用于特異性擴增藍細菌16S rRNA基因片段的寡核苷酸引物。然而，這些基于PCR的測序方法無法在物種或以下進行鑒定，因為DNA片段只有幾百個核苷酸長，其分辨率受到限制。過去十年來，對環境樣本核酸進行直接宏基因組測序已成為探索復雜環境微生物群落組成的有力工具。雖然通過生物信息學工具（如 inStrain 和 PStrain）可成功識別群落中的菌株，但仍然存在一定的局限性。鑒于環境樣品的高復雜性，通常需要足夠的序列深度來提高靈敏度和特異性，這也意味著巨大的測序和計算成本，這對許多研究人員來說仍然不可負擔。此外，技術重現性低，并且在宏基因組分析中準確量化密切相關菌株的相對豐度存在困難，可能會引入顯著偏差。因此，需要一種新方法來解決現有方法的這些缺點。
DNA微陣列最初由數萬個DNA片段排列在載玻璃片上，以進行基因表達分析。從那時起，各種類型的DNA微陣列已被開發用于不同環境中的微生物檢測，包括功能和分類分析。與基于測序的方法相比，微陣列具有幾個優勢，包括高重復性、可靠的定量、相對可負擔的成本和易于使用。鑒于高密度微陣列技術的成熟和藍細菌基因組數據的快速積累，近期中國一研究團隊開發了 CyanoStrainChip，這是一種DNA微陣列芯片，用于環境藍細菌的高通量和高分辨率分類鑒定。該團隊設計了43,666個全基因組菌株特異性探針，用于靶向1277株藍細菌。通過體外模擬群落和野外樣品檢查該芯片的實用性和局限性。結果表明，該微陣列芯片能夠在復雜環境中準確地在菌種水平檢測藍細菌。
CyanoStrainChip目標藍細菌菌株按主要類群呈現。藍細菌主要群體的分支關系，基于先前研究的系統發育分析，利用了834個藍細菌特異性通用單拷貝同源基因基準。
該芯片設計，一共使用了約2500個藍細菌基因組來設計特異性探針，其中包括163個基因組，這些基因組在該研究團隊之前的出版物中已測序，以及約2300個來自NCBI GenBank數據庫的基因組。為了減少數據集的冗余，采用FastANI來生成整個基因組的相似性計算指標，并將所有基因組在99%相似性閾值下聚類成菌株。對于每個菌株簇，保留一個代表性基因組進行下游分析。總共，有1277個基因組保留下來，包括458個純培養基因組、556個單一擴增基因組和263個宏基因組組裝基因組。
采用基于k-mer的方法來發現菌株特異性寡核苷酸，根據寡核苷酸的各種性質（包括探針雜交自由能、熔解溫度、探針次級結構、特異性和復雜性）對候選探針進行過濾。對于每個菌株，如果剩余探針足夠多，則選擇30-40個特異性探針；否則，保留所有剩余探針。選擇的探針被提交到Agilent eArray 5.0程序進行微陣列定制（客制CGH，8×64K平臺）。
CyanoStrainChip數據的預處理。在InnoScan 900掃描儀（該型號現已更新為InnoScan 910） 上掃描的微陣列tiff圖像通過Agilent Feature Extraction（AFE）軟件處理，以生成樣品點原始強度和一系列統計指標。在進行下游分析之前，采取幾個微陣列數據預處理步驟來抵消系統性變化并過濾假陽性。
文獻原文鏈接： https://doi.org/10.1021/acs.est.3c11096
環境藍細菌高通量檢測微陣列芯片
摘要：環境藍細菌因其在生態系統中的關鍵作用而備受關注。 中國研究團隊近期開發了一種名為 CyanoStrainChip 的新型DNA 微陣列芯片，可對環境藍細菌進行菌株水平的全面分析。 通過 43,666個全基因組、菌株特異性探針涵蓋幾乎所有藍細菌主要類群。 使用CyanoStrainChip無需培養藍細菌，與傳統方法相比成本更低，計算要求更低，定量效果更好。
藍細菌代表一個廣泛而普遍存在的光合自養原核生物門，以其非凡的遺傳多樣性而聞名。這些微生物存在于幾乎所有環境中，并在生態系統中發揮關鍵作用，不僅是地球大氣氧氣的重要貢獻者，還是次生代謝產物的多產者。在某些情況下，藍細菌會導致有害的水華，釋放毒素進入淡水和海洋環境，對生態系統結構和功能，以及用于娛樂、飲用水、漁業和人類健康的水質構成嚴重威脅。事實上，在各種生態系統中對藍細菌多樣性和豐度進行分析將對生態研究和有害藻華監測、評估和管理至關重要。
然而，當前研究普遍忽視了藍細菌種內多樣性，導致在種或以上的概括性結論，并未考慮菌株差異的可能性。許多屬于同一藍細菌屬（或種）的多個分離株比較研究，如 Raphidiopsis、Planktothrix 和 Microcystis，證明它們在形態、生理、毒素和遺傳學方面存在相當大的種內多樣性。但是目前環境藍細菌的高通量檢測方法很難達到菌株水平。基于聚合酶鏈反應 (PCR) 的靶向標記基因DNA 測序是克服藍細菌多樣性評估中表型表征局限性，最廣泛使用的技術。早在1997年，就開發出了一組用于特異性擴增藍細菌16S rRNA基因片段的寡核苷酸引物。然而，這些基于PCR的測序方法無法在物種或以下進行鑒定，因為DNA片段只有幾百個核苷酸長，其分辨率受到限制。過去十年來，對環境樣本核酸進行直接宏基因組測序已成為探索復雜環境微生物群落組成的有力工具。雖然通過生物信息學工具（如 inStrain 和 PStrain）可成功識別群落中的菌株，但仍然存在一定的局限性。鑒于環境樣品的高復雜性，通常需要足夠的序列深度來提高靈敏度和特異性，這也意味著巨大的測序和計算成本，這對許多研究人員來說仍然不可負擔。此外，技術重現性低，并且在宏基因組分析中準確量化密切相關菌株的相對豐度存在困難，可能會引入顯著偏差。因此，需要一種新方法來解決現有方法的這些缺點。
DNA微陣列最初由數萬個DNA片段排列在載玻璃片上，以進行基因表達分析。從那時起，各種類型的DNA微陣列已被開發用于不同環境中的微生物檢測，包括功能和分類分析。與基于測序的方法相比，微陣列具有幾個優勢，包括高重復性、可靠的定量、相對可負擔的成本和易于使用。鑒于高密度微陣列技術的成熟和藍細菌基因組數據的快速積累，近期中國一研究團隊開發了 CyanoStrainChip，這是一種DNA微陣列芯片，用于環境藍細菌的高通量和高分辨率分類鑒定。該團隊設計了43,666個全基因組菌株特異性探針，用于靶向1277株藍細菌。通過體外模擬群落和野外樣品檢查該芯片的實用性和局限性。結果表明，該微陣列芯片能夠在復雜環境中準確地在菌種水平檢測藍細菌。
CyanoStrainChip目標藍細菌菌株按主要類群呈現。藍細菌主要群體的分支關系，基于先前研究的系統發育分析，利用了834個藍細菌特異性通用單拷貝同源基因基準。
該芯片設計，一共使用了約2500個藍細菌基因組來設計特異性探針，其中包括163個基因組，這些基因組在該研究團隊之前的出版物中已測序，以及約2300個來自NCBI GenBank數據庫的基因組。為了減少數據集的冗余，采用FastANI來生成整個基因組的相似性計算指標，并將所有基因組在99%相似性閾值下聚類成菌株。對于每個菌株簇，保留一個代表性基因組進行下游分析。總共，有1277個基因組保留下來，包括458個純培養基因組、556個單一擴增基因組和263個宏基因組組裝基因組。
采用基于k-mer的方法來發現菌株特異性寡核苷酸，根據寡核苷酸的各種性質（包括探針雜交自由能、熔解溫度、探針次級結構、特異性和復雜性）對候選探針進行過濾。對于每個菌株，如果剩余探針足夠多，則選擇30-40個特異性探針；否則，保留所有剩余探針。選擇的探針被提交到Agilent eArray 5.0程序進行微陣列定制（客制CGH，8×64K平臺）。
CyanoStrainChip數據的預處理。在InnoScan 900掃描儀（該型號現已更新為InnoScan 910） 上掃描的微陣列tiff圖像通過Agilent Feature Extraction（AFE）軟件處理，以生成樣品點原始強度和一系列統計指標。在進行下游分析之前，采取幾個微陣列數據預處理步驟來抵消系統性變化并過濾假陽性。
InnoScan 910 微陣列掃描儀
文獻原文鏈接： https://doi.org/10.1021/acs.est.3c11096
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