自2019年 12月出現 COVID-19 大流行以來，SARS-CoV-2 病毒不斷演變為世界各地出現的許多變種。目前，主要采用兩種方法來識別 SARS-CoV-2 變異株：通過測序對完整病毒基因組進行測序，以及定量逆轉錄 PCR。盡管基因組測序非常準確并可識別任何突變，但常規基因組測序成本高、耗時，且需專門設備與生信解讀。相比之下，基于PCR 技術，例如定量 PCR 、熔解溫度 RT-PCR 和基于 CRISPR-Cas13a 的轉錄擴增 ，可同時識別單個或少數突變（4 個，最多 5 個，因可用熒光通道數量有限）。因此，迫切需要開發一種簡單、靈敏、快速的檢測方法，以同時準確識別多種變異株。意大利科學家最近開發了一種基于微陣列的檢測方法，通過同時檢測刺突蛋白基因突變來區分臨床樣本中存在的已知病毒變異株。
SARS-CoV-2 正鏈 RNA 基因組大小約為 30 kb，編碼 29 種蛋白質，突變率約為每月兩次非同義突變。在疫苗快速開發的早期，因首波流行大量患者死亡，新變種免疫逃逸并未被視為優先事項。在影響免疫逃逸變異株各因素中，免疫功能低下人群中觀察到的長排毒期,是突變逃逸因素之一。

臨床顯著突變主要發生在刺突蛋白（S 蛋白，圖1），這是一種介導靶細胞識別和融合的三聚體包膜糖蛋白。 S蛋白結構任何改變都可能影響病毒感染，并最終決定病毒選擇性優勢，影響不同變體感染動力學。導致全球大多數感染的五種變異株是 B.1.1.7（ Alpha 變種）、B.1.351（Beta 變種）、B.1.1.28（Gamma 變種 ）、B.1.617.2（Delta 變體）和更大譜系 B.1.1.529（Omicron1、Omicron2 和 Omicron5 變體）。
  圖 1. (a) 刺突蛋白由三個刺突單體組成，在 SARS-CoV-2 表面形成同源三聚體結構（刺突三聚體）。每個單體分為兩個亞基，即 S1 和 S2，在弗林蛋白酶切割位點連接。在病毒融合過程中，S1 亞基中的受體結合域 (RBD) 與宿主細胞靶受體 ACE2 結合，而 S2 則實現膜融合。 (b) SARS-CoV-2 S蛋白S1亞基的示意圖和氨基酸序列。每個變體中存在的突變位置，包括 擴增子1（S 蛋白編碼序列中的位置 23 至 289 nt）和 擴增子2（S 蛋白編碼序列中的位置 1215 至 1545 nt）。 S1：胞外域S1亞基； S2：胞外域S2亞基； NTD：N 末端結構域；RBD：受體結合結構域；RBM：受體結合基序； CTD：C 端結構域。
 
 
 
在該研究中，該研究團隊設計雙域核酸探針，區分域用于特異性結合S蛋白突變序列PCR擴增產物（表一），編碼結合域能與芯片表面捕獲探針特異結合（表二和圖二）。PCR產物標有Cy3染料，可被熒光掃描儀檢測。（圖三）。    
圖 2. 實驗示意圖。 (a) 在 L452R 突變的情況下（包含點突變的核苷酸三聯體以黃色突出顯示，突變以紅色突出顯示），L452R 雙域核酸探針在溶液中與 Cy3 標記的單鏈 PCR 雜交，而 L452 Wt 報告基因則無雜交。 (b) 雙域核酸探針 3' 不同編碼的結合域（不同顏色代表序列差異）通過與芯片表面相應捕獲探針雜交將標記的 PCR產品結合到微陣列芯片不同位置。 (c) 將 Cy3-標記的反向引物整合到 PCR 擴增子中，通過InnoScan710熒光掃描儀檢測S 蛋白基因突變。該圖顯示L452R 突變的樣品點信號強，非突變 L452 Wt的樣品點無信號。
 
   
圖 3.(a)  雙域核酸探針和Cy3 標記的多重PCR擴增產物示意圖。雙域核酸探針的區分域小黑 x 表示突變。人 β-肌動蛋白擴增子 (Amplicon3) 直接與微陣列表面捕獲探針雜交。 (b) Omicron BA.1、BA.2 和 BA.5 亞變體的特定突變特征。檢測到的突變株顯示在列中，子變株顯示在行中。每個Omicron 亞變體都可通過特定突變組合模式來識別。 (c) 微陣列點樣方案。 (d) 四個硅芯片 Cy3 熒光圖像。攜帶 BA.1、BA.2、BA.5 亞變株和無 DNA 模板對照 (NTC) 樣品的 Cy3 標記 PCR產物（擴增子1、2 和 3）與雙域核酸探針撫育，然后進行芯片雜交。圖中黃色方塊用于突出顯示雜交斑點。斑點大小為 400 μm，間距為 800 μm。
 
      這種高特異性多重檢測實驗可對引起全球感染浪潮的病毒變異株進行基因分型。該實驗的靈活性允許通過增加捕獲探針和雙域核酸探針來檢測新變異株。
   
 
 
 
文獻原文鏈接：  https://doi.org/10.3390/bios13020269