數(shù)字PCR（dPCR）是一種核酸絕對定量的技術(shù)，與傳統(tǒng)的熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）相比，dPCR擁有可以精確到單個核酸分子的高精準(zhǔn)度、適合復(fù)雜樣本的高便捷度、且無需標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因進(jìn)行對比分析等特點。因此，高靈敏度、絕對定量、高穩(wěn)定性和更高的抗干擾能力成為數(shù)字PCR的4大優(yōu)勢。
 

作為最常見的腫瘤之一，胃癌(GC)具有高死亡率，因為當(dāng)前的檢查方法不能實現(xiàn)早期診斷。核粒梭菌(Fn)主要定居在口腔中，據(jù)報道與胃腸道腫瘤的發(fā)展有關(guān)。迄今為止，關(guān)于唾液Fn和胃癌之間的關(guān)系知之甚少。該篇來自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院文章確定唾液Fn能否作為診斷胃癌的生物標(biāo)志物，并探討Fn對胃癌細(xì)胞的影響。

實驗方法：通過液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)對2019年1月至2020年12月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院的120例GC患者、31例萎縮性胃炎(AG)患者、35例非AG (NAG)患者、26例胃息肉(GP)患者和20例正常對照(NC)的唾液中Fn的豐度進(jìn)行定量。進(jìn)行受試者工作特征(ROC)曲線分析，以評估Fn以及傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物(包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA) 19-9和CA72-4)的診斷價值。Transwell實驗和傷口愈合實驗評估Fn感染對GC細(xì)胞的影響。western blot法檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記物的表達(dá)。

★實驗流程：

• 研究人員的樣本收集，120例GC患者、31例萎縮性胃炎(AG)患者、35例非AG (NAG)患者、26例胃息肉(GP)患者和20例正常對照(NC)的唾液樣本的收集，離心后儲存在-80℃。
• 使用凱杰QIAamp Blood Mini Kit試劑盒提取200ul唾液樣本中的基因組DNA，濃度用Qubit 3熒光計測定。
• 使用上海小海龜數(shù)字PCR儀進(jìn)行Fn的測定，設(shè)計Fn的探針進(jìn)行檢測。
• GC細(xì)胞的培養(yǎng)，F(xiàn)n的菌株培養(yǎng)
• 將GC細(xì)胞和Fn的菌株共培養(yǎng)，進(jìn)行感染
• 將感染后的GC細(xì)胞進(jìn)行Transwell分析
• 傷口愈合實驗，感染后的GC細(xì)胞進(jìn)行Transwell分析，感染后用200 μL的移液管尖端進(jìn)行直線刮擦，模擬傷口，隨后，除去培養(yǎng)基和漂浮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基代替，并捕獲圖像。細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，再次拍攝圖像。
• Western blot分析，將感染Fn和未感染Fn的GC細(xì)胞裂解進(jìn)行Western blot分析

實驗結(jié)果：核粒梭菌(Fn)是一種牙周致病菌，常見于胃腸道腫瘤組織中。在此，研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者唾液Fn水平升高，可作為胃癌診斷的潛在生物標(biāo)志物，其診斷能力優(yōu)于傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物。研究還發(fā)現(xiàn)唾液Fn水平與胃癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。此外，實驗在試管內(nèi)揭示了Fn通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來促進(jìn)GC細(xì)胞的遷移和侵襲。該發(fā)現(xiàn)表明唾液Fn是診斷胃癌的潛在生物標(biāo)志物。該研究表明唾液中Fn含量可作為診斷胃癌的生物標(biāo)志物，F(xiàn)n感染可通過加速上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移。