類器官是復雜的 3-D 器官樣微組織，由多種分化的細胞類型組成，其結構組織類似于體內發現的細胞，具有中央腔和其他類似體內的結構特征。從ipsc誘導多能干細胞 產生的類器官已被描述用于胃、腸、肺、大腦、腎、肝臟等各種組織，這些類器官是其他體外模型的有吸引力的替代品；這些微組織比 2-D 細胞培養或簡單的 3-D 球體聚集體更好地概括了體內組織表型，但沒有與器官外植體或組織切片相關的挑戰，例如培養壽命有限。事實上，類器官保留了許多細胞培養的典型有利特征，例如維持穩定培養數月的能力，以及冷凍保存和恢復培養物的能力。類器官也適用于許多標準實驗室技術，包括使

用 CRISPR/Cas9 進行基因修飾、免疫熒光染色、RNA 表達定量、蛋白質印跡和毒性測定。類器官培養物已被用于基礎研究和轉化研究。例如，腸道類器官已被證明可在體內植入，用作囊性纖維化模型使用來源的肺 iPSC，并探索宿主與細菌與沙門氏菌的相互作用。 腎臟類器官已用于研究腎毒性，胃類器官被證明是幽門螺桿菌感染的合適模型。在這里，我們簡要介紹了一種，用于在特定培養基中結合使用 2-D 和 3-D 培養的方式從三個 人類 iPSC 細胞系（ 生成胃腸道 (GI) 類器官。

ipsc誘導多能干細胞 誘導分化培養
簡而言之，使用多能干細胞培養基在無飼養層和無血清條件下將iPSC 維持在  細胞基底膜包被的培養皿上。每天更換培養基。在常規 iPSC 培養過程中，細胞每 3-5 天使用干細胞解離試劑傳代一次，并作為小聚集體接種。對于類器官的生成，使用了未顯示自發分化跡象的低傳代 iPSC。


iPSC 誘導分化步驟：

一、定形內胚層分化

根據說明書重構所有利基因子，并在 -80°C 下作為一次性等分試樣儲存。iPSC 被接種到 Cell Basement 包被的 24 孔多孔板中，并生長至 30-50% 的匯合度。B27 補充劑 和 100 ng/mL 激活素 A 組成的定形內胚層 (DE) 分化培養基替換培養基三天。第一天，DE 培養基還含有 2 µM
CHIR99021。培養基是新鮮的并且每天更換三天。

二、后腸球體生成

在 DE 誘導后，通過在 RPMI-1640、B27、100 ng/mL 激活素 A、3 µM CHIR99021 和 500 ng/mL 成纖維細胞生長因子 4（FGF4）中培養四天，生成中/后腸球體。媒體是新鮮的，每天都在變化。

三、后前腸球體生成

在 DE 誘導后，通過在 RPMI-1640、B27、2 µM CHIR99021、500 ng/mL FGF4 和 200 ng/mL noggin 中培養三天，生成后前腸球體。第一天，培養基還含有 2 µM 視黃酸 。每天更換媒體。媒體每天都是新鮮的。

四、腸道類器官生成

收集中/后腸球體并重新懸浮在冰冷、未稀釋的細胞基底中。大約 10-20 個球體被鍍在 24 孔板的每個孔中，每滴 50 μL。鋪板后，將板在 37°C 下保持 15 分鐘以使凝膠聚合，在孔中心形成 3-D 圓頂。凝固的凝膠覆蓋有預熱的完整腸道類器官培養基，該培養基由 Advanced DMEM:F12、N2 補充劑 、B27 補充劑、L-谷氨酰胺、10 mM HEPES 、100 ng/mL 表皮生長因子（EGF）、100 ng/mL noggin和 500 ng/mL R-spondin-1。每 3-4 天更換一次培養基，每 7-14 天通過機械解離將類器官傳代到新鮮的細胞基底中。完整培養基在 4°C 下儲存不超過三天。

五、胃類器官生成

收集后部前腸球體并重新懸浮在未稀釋的細胞基底中。大約 10-20 個球體被鍍在 24 孔板的每個孔中，每滴 50 μL。接種后，將板在 37°C 下保持 15 分鐘以聚合凝膠，在孔中心形成 3-D 圓頂。凝固的凝膠覆蓋有預熱的完整胃類器官培養基，包括高級 DMEM：F12、N2 補充劑、B27 補充劑、L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、100 ng/mL EGF、200 ng/mL noggin 和 2 µM 視黃酸酸。每 3-4 天更換一次培養基，每 7-10 天將類器官嵌入新鮮的細胞基底中。完整培養基在 4°C 下儲存不超過三天。

六、免疫熒光和免疫組織化學

細胞單層、球體或組織在 PBS磷酸鹽緩沖液中洗滌兩次， 并在室溫下固定在 4% 多聚甲醛中 15 至 30 分鐘。固定的球體/類器官被包埋在石蠟中，以 5-10 µm 切片，并安裝在幻燈片上用于后續染色。對于免疫熒光染色，細胞單層或組織切片在含有 5% 驢血清、0.5% Triton-X、0.2% Tween-20 和 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中在室溫下封閉和透化 1 小時。一抗在封閉緩沖液中稀釋，并在 4°C 下與細胞一起孵育過夜。熒光二抗在封閉緩沖液中稀釋，并與細胞在室溫下避光孵育 1 小時。使用蘇木精、曙紅和 PAS-Alcian Blue 進行組織學染色。 

總結

 在體內，DE 產生消化道，是 GI 類器官發育過程中關鍵的第一步。免疫染色顯示，在 DE 分化培養基中三天后，特征性 DE 標記物 FOXA2 和 SOX17 的表達超過 80%，并且中胚層標記物 brachyury（數據未顯示）的表達較小。


   
在前腸或后腸分化培養基中 3 至 4 天后，形成漂浮或半粘附的球體以及粘附的細長管狀結構。后腸分化培養基產生的球體對腸道標記物 CDX2 呈陽性，但對后腸標記物 SOX2 呈陰性，而前腸分化培養基產生的球體為 CDX2-/SOX2+。

在球體嵌入 ATCC 細胞基底膜并保存在類器官生成培養基中后的 7 天內，大的簡單圓形類器官變得可見，直徑約為 100-200 µm。到第 30 天時，類器官的大小和復雜性大大增加，直徑為 1500-2000 µm，并且有許多可見的管狀和隱窩/芽狀結構。
   
30 天以上類器官的免疫染色顯示復雜的折疊結構、柱狀上皮、隱窩樣結構和許多胃腸道標志物的表達，包括前腸標志物 PDX1、后腸標志物 CDX1、MUC1 和 MUC5AC 陽性粘蛋白分泌細胞、溶菌酶 (LYSO) - 陽性潘氏細胞和絨毛蛋白 (VILL) 陽性腸細胞。類器官周圍的細胞包含異質細胞群，這些細胞表達波形蛋白 (VIM)、纖連蛋白和平滑肌α肌動蛋白 (α-SMA)。粘蛋白表達僅限于杯狀細胞和類器官的中央腔，其中還含有死細胞和碎片. 用 H&E 和 PAS-Alcian Blue 進行的組織學染色顯示存在酸性和中性粘蛋白，以及成熟類器官內的組織樣形態。



與簡單的 3-D 球體或傳統的 2-D 培養模型相比，類器官可以更忠實地再現復雜的生理結構。然而，類器官并非沒有局限性。雖然 iPSC 衍生的 GI 類器官表現出體內組織的許多特征，但它們不能完全捕捉成熟組織的表型。例如，它們缺乏體內組織的許多方面，例如脈管系統以及與神經和免疫系統的相互作用。此外，雖然類器官在體內顯示出類似細胞的組織結構，但它與原代胃腸道組織中的組織結構并不一致，而且任何單個類器官的大小、復雜性、活力和特定細胞類型的表達都可能存在顯著差異。雖然用于生成類器官的分化培養基可能是完全定義的，但大多數類器官方案依賴于未定義的、小鼠來源的細胞外基質，這限制了它們的臨床應用。盡管存在這些挑戰，類器官培養方法仍然是一種有用的工具，可以增加我們對器官發育的理解，并為藥物篩選或再生醫學等個性化醫學方法帶來希望。

類器官的產生嚴重依賴于各種利基因素的貢獻和特定組織適當信號通路的暫時受限激活。我們發現實驗中中使用的許多重組蛋白和小分子的活性存在顯著的批次間和供應商間差異。類器官的生成依賴于一系列特定的發育事件，這些事件嚴重依賴于先前的階段。特別是，如果iPSC 的 DE 形成的初始步驟不是 80-90%，我們發現類器官生成通常不成功。另外，一些分化標記在類器官達到一定的成熟階段之前并不明顯；我們建議將 GI 類器官培養至少 30 天，在某些情況下，可能需要 60 天以上才能出現完整的細胞類型。