人體每天都會產生上億個死亡細胞。將舊細胞清除，給新的細胞留出位置，才能夠使組織或器官保持活力與穩(wěn)態(tài)。如果清除過程不順利，則有可能會導致不良后果，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡誘因之一就是凋亡細胞的積累誘發(fā)細胞繼發(fā)性壞死，釋放與損傷相關的分子模式，導致大范圍的炎癥反應。因此，清除死亡細胞對維持體內平衡具有重要意義。

胞葬作用 (Efferocytosis) 就是指吞噬細胞清除程序性死亡細胞的過程。在大多數(shù)組織中，胞葬作用由專職性吞噬細胞 (巨噬細胞和樹突細胞) 或垂死細胞附近的非專職性吞噬細胞 (上皮細胞和纖維細胞) 來完成。胞葬作用能夠阻止垂死細胞發(fā)生繼發(fā)性壞死，以免釋放出可能引起炎癥的有害細胞內容物 (如氧化物和蛋白酶)。那么吞噬細胞是如何識別垂死細胞并清除掉它們的呢？ 來聽聽胞葬作用的三部曲~Find-Eat-Digest~♪ 

 

• 垂死細胞躲貓貓？Find！

垂死細胞會釋放出可溶性介質，這些介質中就包含讓吞噬細胞識別的 “Find me” 信號，包括核苷酸 (如 ATP, UTP)、膜脂 (如磷酸鞘氨醇)、趨化因子 (如 CX3CL1) 等。這些信號不僅能吸引吞噬細胞，還能使吞噬細胞做好 “作戰(zhàn)” 的準備，例如增強吞噬受體和消化機制的表達。

 

凋亡細胞的核苷酸 “Find me” 信號可通過 pannexin 通道 (被凋亡過程中 caspase 3/7的裂解激活) 釋放 (圖 1)。釋放的 ATP 通過嘌呤受體 P2Y 誘導吞噬細胞遷移。此外，核苷酸還能夠調節(jié)巨噬細胞的免疫機制。例如，凋亡細胞的 ATP 或 AMP 可轉化為腺苷，腺苷再通過腺苷受體抑制炎癥，上調抗炎 (anti-inflammatory) 和促消炎 (pro-resolution) 基因表達 (包括 Nr4a1 和血小板反應蛋白)。 非凋亡細胞的脂膜完整性被破壞，炎癥信號直接被釋放到細胞外。被病原體感染的細胞會釋放病原體相關分子模式 (PAMP)，該信號可與吞噬細胞上或吞噬細胞中的模式識別受體 (PRR) 結合，影響巨噬細胞的功能和免疫激活。另外，非凋亡細胞也會釋放損傷相關分子模式 (DAMP)，觸發(fā)炎癥反應，可作為巨噬細胞的趨化因子。  

圖 1. 吞噬細胞識別凋亡細胞^[1]

凋亡細胞釋放 “Find me” 信號 (核苷酸、膜脂、趨化因子等)，吞噬細胞上相應的受體與之結合，誘導吞噬細胞遷移、上調抗炎/促消炎基因表達，以及調節(jié)細胞骨架 

• 找到美味大餐！Eat！

吞噬細胞遷移到凋亡細胞附近后，表面受體識別凋亡細胞的 “Eat me” 信號，與之結合。“Eat me” 信號包括磷脂酰絲氨酸 (Phosphatidylserine, PS)、鈣網(wǎng)蛋白、氧化低密度脂蛋白等，其中 PS 是最有效、進化上最保守的信號分子。所有形式的細胞死亡的一個共同特征是質膜中磷脂不對稱性的喪失，PS就會暴露在細胞外，促進死亡細胞被吞噬。凋亡過程中，位于細胞內側的 PS 會在早期階段從內側翻轉到表面。吞噬細胞的 PS 受體可以直接或間接識別暴露在表面的 PS。BAI1 (PS 受體) 與 PS 結合后，通過 ELMO1-DOCK 復合物啟動細胞內信號傳導，以誘導 Rac1 介導的肌動蛋白細胞骨架重排 (圖 2)，為 “吃掉” 凋亡細胞做好準備。 
與之相對的是，健康細胞表面暴露 “Don't eat me” 信號，包括 CD47 和 CD24。活細胞上的 CD47 與巨噬細胞的 SIRPα 結合，導致 SIRPα 胞質結構域的酪氨酸磷酸化，募集到的 SHP1/2 再通過非肌肉肌球蛋白 IIA 來抑制吞噬作用 (圖 2)。這些信號能使健康細胞避免被吞噬細胞清除。

 

圖 2. 吞噬細胞結合凋亡細胞^[1]

吞噬細胞直接 (BAI1, TIM1) 或間接 (AXL, MerTK) 識別凋亡細胞表面的 PS，激活 ELMO 和 DOC 蛋白的表達，進而激活 GTPase RAC1，增強肌動蛋白重塑和吞噬杯的形成。健康細胞表面的 CD47 能阻止被吞噬

  

• 吃太撐了？Digest！

 

• 垂死細胞的吞噬

在與垂死細胞結合后，吞噬細胞啟動肌動蛋白重塑，質膜內陷及局部外溢形成吞噬體，通過胞吞作用將垂死細胞 “吃掉”。胞吞后形成吞噬體，吞噬體膜會發(fā)生多種生化變化，這些過程由 Rab GTPase 蛋白家族控制。吞噬體成熟后，通過形成 Ca²⁺ 依賴性 SNARE 復合物 (由 VAMP7 和 Syntaxin 7 組成) 與溶酶體直接融合 (圖 3a)。溶酶體內有大量蛋白酶、核酸酶和脂肪酶，可消化吞噬體中凋亡細胞。另外還有 LC3 (微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈 3) 相關吞噬作用 (LAP) 通路 (圖 3b)。吞噬細胞吞噬垂死細胞后，LAP PI3K 復合物被募集到含有凋亡細胞的LAP相關吞噬體 (LAPosome)，該復合物對 LAPosome 的保持至關重要，并且激活了 LC3 的連接機制。LC3 的連接促進了 LAPosome 與溶酶體融合，提高了清除死細胞的效率并且保持免疫沉默。 

圖 3. 吞噬細胞吞噬凋亡細胞^[2]

a. 溶酶體降解途徑：VPS34 被募集到RAB5-positive早期吞噬體，催化磷脂酰肌醇形成 PI3P (這些都是吞噬體成熟所必需的物質)，早期吞噬體成熟為晚期吞噬體后，最終與溶酶體融合。b. LAP 通路：LAP PI3K 復合物 (由 Beclin 1、VPS34、VPS15、UVRAG 和 Rubicon 組成) 激活 LC3 與 LAPosome 的連接，促進 LAPosome 的成熟，以及與溶酶體融合

• 垂死細胞的消化

溶酶體中含有大量蛋白酶、核酸酶、脂肪酶。吞噬體與溶酶體結合后，形成新的吞噬溶酶體 (Phagolysosome)。高酸度的環(huán)境 (pH=4.5~5.0) 和活性組織蛋白酶能降解垂死細胞。吞噬細胞還可重利用一些降解的垂死細胞成分。 

大部分情況下，死亡細胞的數(shù)量都是遠遠超過吞噬細胞，所以吞噬細胞需要同時清除多個細胞。而垂死細胞帶有膜、膽固醇、蛋白質、核酸等，這些物質需要被代謝。這對于吞噬細胞來說是巨大的負擔，需要控制其自身的體積和表面積以及迅速改變免疫代謝環(huán)境。凋亡細胞本身也能改變吞噬細胞的免疫代謝 (圖 4)：(1) 凋亡細胞表面的 PS 與受體結合后能激活或上調 LXR 和 ABCA1，可促進膽固醇的代謝與輸出；(2) 凋亡細胞線粒體的脂肪酸氧化可促進抗炎因子 IL-10 的表達；(3) 吞噬細胞利用凋亡細胞的精氨酸 (Arginine) 驅動肌動蛋白細胞骨架重排，促進之后幾輪的凋亡細胞攝取；(4) 糖酵解與葡萄糖輸入的增加也促進 ATP 生成和肌動蛋白聚合。

   

圖 4. 凋亡細胞調節(jié)吞噬細胞免疫代謝環(huán)境^[1]

 

常規(guī)的胞葬作用研究是在體外進行，例如使用原代人巨噬細胞和凋亡 Jurkat T 細胞進行免疫熒光染色后，可在顯微鏡下觀察到胞葬作用的過程^[3]。但由于凋亡細胞易被清除，在體內檢測仍是個巨大的挑戰(zhàn)。不過，辦法總比困難多嘛~

 

Raymond 等人開發(fā)了一種基因編碼的熒光報告基因 CharON，實現(xiàn)了在果蠅胚胎發(fā)育過程中胞葬作用的活細胞追蹤^[4]。這一研究結果于今年 3 月發(fā)表在 Science 雜志上。

 

研究者們首先設計了針對細胞凋亡和胞葬作用的傳感器。針對細胞凋亡，他們設計了 一種綠色熒光蛋白 (GFP) 探針。細胞凋亡時表達的 caspases 3/7 能切割 GFP，使之發(fā)出熒光 (圖 5a)；GFP 在溶酶體的酸性條件下易淬滅，經突變 Q204H 基因后， GFP 對 pH 耐受。經過以上改造，他們設計出 pH 耐受的綠色熒光探針 pH-CaspGFP——它能準確地報告凋亡的細胞。針對吞噬作用，他們設計了一種新的紅色熒光 pH 值傳感器 pHlorina，它隨著 pH 值的降低而增加熒光強度。最后將這兩種傳感器結合起來，獲得探針 “CharON” (圖 5b)。CharON 轉基因的細胞，在凋亡時首先發(fā)綠色熒光，在被吞噬并在溶酶體內酸化后，隨著 GFP 逐漸淬滅，pHlorina 的紅色熒光強度增加。CharON 將連續(xù)性細胞事件可視化。

 

為了追蹤體內胞葬過程，研究者培育出 CharON 轉基因果蠅。在果蠅胚胎發(fā)育的中后期，發(fā)育中的中樞神經系統(tǒng) (CNS) 有一波細胞凋亡。CharON 使體內胞葬過程更完整地呈現(xiàn)出來，包括細胞凋亡、吞噬細胞募集、Find、Eat 和 Digest (圖6)。通過 CharON 還觀察到，胚胎果蠅 CNS 中清除凋亡細胞的“重任”由具有吞噬功能的神經膠質細胞和分散的腹側血細胞 (巨噬細胞) 共同承擔。并且還觀察到神經膠質細胞和巨噬細胞中吞噬體的大小也有差異，巨噬細胞中凋亡細胞的熒光更密集。 

 

圖 6. CharON 可視化果蠅胚胎內胞葬作用的不同階段^[4]

0~1 min：凋亡細胞募集巨噬細胞；2 min：凋亡細胞與巨噬細胞結合；3~5 min：巨噬細胞吞噬。MΦ (藍色虛線輪廓)：GFP 標記的巨噬細胞；A.C. (虛線輪廓)：凋亡細胞。細胞凋亡誘導 pH-CaspGFP (綠色) 激活和巨噬細胞 (綠色) 遷移，靶標與受體結合后被吞噬，消化后通過增加 pHlorina 信號 (紅色) 檢測凋亡細胞的酸化/降解 胞葬作用涉及多個信號通路，包括受體網(wǎng)絡、細胞溶質信號分子、細胞骨架快速重排、凋亡細胞消化和免疫代謝通路。這些通路運行不暢則有可能導致多種胞葬缺陷相關疾病 (神經退行性疾病、視網(wǎng)膜變性、動脈粥樣硬化、癌癥等)，因此了解胞葬作用機制對于治療這些疾病更有重要意義。盡管研究之路還很漫長，但相信總有一天我們能攻破難題~ 

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參考文獻

1. Parul Mehrotra, Kodi S. Ravichandran. Drugging the efferocytosis process: concepts and opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2022; 21(8): 601-620. 
2. Emilio Boada-Romero, et al. Mechanisms and physiology of the clearance of dead cells by efferocytosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020 Jul; 21(7): 398-414. 
3. Evans AL, Heit B, et al. Quantitative Efferocytosis Assays. Methods Mol Biol. 2017;1519:25-41. 
4. Raymond MH, Ravichandran KS, et al. Live cell tracking of macrophage efferocytosis during Drosophila embryo development in vivo. Science. 2022 Mar 11;375(6585):1182-1187.