文章標題：The microbial metabolite trimethylamineN-oxide promotes antitumor immunity in triple-negative breast cancer

發表期刊：CellMetabolism

發表時間：2022年3月

影響因子：27.287

合作客戶：復旦大學附屬腫瘤醫院

百趣提供服務：氧化三甲胺高通量靶標代謝組學檢測

研究背景
三陰性乳腺癌(TNBC) 是一種侵襲性疾病，預后差，免疫治療在患者中取得的成功有限。三陰性乳腺癌(TNBC)的四種亞型中，IM亞型的特點是在微環境中富集免疫激活細胞和免疫刺激因子，提示TNBC的IM亞型患者可能對免疫治療有更好的反應。因此，迫切需要找到調節TNBC微環境、促進抗腫瘤免疫的因子。

本研究對FUSCCTNBC隊列（n=360）的轉錄組、代謝組和微生物組數據進行了全面分析，發現TMAO通過誘導腫瘤細胞焦亡，從而增強TNBC體內CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫，提高免疫治療療效。該研究為微生物群-代謝-免疫相互作用提供了新的見解，并表明微生物代謝物，如TMAO或其前體膽堿，可能代表了一種新的治療策略，以促進免疫治療對TNBC的療效。

研究結果1、在TNBC中，微生物代謝物TMAO與免疫激活微環境相關
對TNBC患者的腫瘤組織(FUSCCTNBC隊列；n=360)微生物組成進行分析，并將隊列分為IM亞型和非IM亞型，IM亞型中梭菌目下菌屬的占比更為豐富（圖1D）。進行非靶向代謝組學，從IM亞型篩選出顯著富集的梭菌相關代謝物TMAO(圖1E、1F)，發現T細胞相關通路在高TMAO亞群中富集(圖1H)，CD8+T細胞及IFNG的表達的在其中的豐度明顯更高(圖1I、1J)。表明TNBC不同亞型微環境的共生菌群組成存在差異，TMAO與TNBC免疫激活微環境之間成正相關。
 

圖1. 在TNBC中，微生物代謝物TMAO與免疫激活微環境相關

2.TMAO通過激活CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫來抑制腫瘤生長
構建小鼠66cl4TNBC細胞模型(圖2A)，表明腫瘤內聯合注射TMAO顯著促進CD8+T細胞和M1巨噬細胞的浸潤，增強CD8+T細胞的功能并有效抑制三陰性乳腺癌的生長(圖2A-2E)。說明腫瘤微環境中TMAO水平升高可有效增強抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長。
 

圖2. TMAO通過激活CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫來抑制腫瘤生長

3.TMAO誘導gsdme介導的腫瘤細胞焦亡
形態學水平上和乳酸脫氫酶釋放試驗顯示TMAO處理的癌細胞發生焦亡(圖3A、3B)。Western blot結果顯示，參與細胞焦亡的兩個關鍵蛋白——裂解的caspase3和GSDME在TMAO處理后表達上調(圖3C)。用發夾RNA敲除Gsdme的表達，結果顯示TMAO處理對植入shGsdme和植入表達了正常混亂shRNA的細胞株的小鼠的影響極小(圖3G和3H)。敲除Gsdme阻斷了TMAO誘導的CD8+T細胞抗腫瘤免疫增強和腫瘤生長抑制(圖3I)。表明TMAO通過誘導gsdme介導的腫瘤細胞焦亡來激活TNBC的抗腫瘤免疫。

圖3. TMAO誘導gsdme介導的腫瘤細胞焦亡

4.PERK是TMAO誘導細胞焦亡所必需的
用小鼠模型進一步驗證蛋白激酶R-like內質網激酶（PERK）在體內激活細胞焦亡的能力(圖4E)。結果表明TMAO處理顯著抑制腫瘤生長，促進CD8+T細胞浸潤，而PERK抑制劑減弱了TMAO誘導的抗腫瘤免疫(圖4F和4G)。用PERK抑制劑治療小鼠，可在體內阻止TMAO誘導的內質網應激的PERK依賴通路的激活和GSDME介導的細胞凋亡(圖4H)，進而抑制CD8+T細胞浸潤。說明TMAO激活了PERK介導的內質網應激，從而導致caspase-3的激活和GSDME介導的腫瘤細胞焦亡。
 

圖4. PERK是TMAO誘導細胞焦亡所必需的

5.高血漿TMAO與晚期TNBC患者免疫治療效果改善相關
收集使用抗pd-1抑制劑治療5個周期患者的血漿樣本進行臨床評估，發現高血漿TMAO水平的患者對免疫治療反應性更好(圖5A-5E)。將攜帶66cl4或4T1乳腺癌的小鼠腹腔注射TMAO以誘導高血漿TMAO(圖5F)，證實提高血漿TMAO水平可以有效抑制小鼠腫瘤的生長（圖5F-5I）。
 

圖5. 高血漿TMAO與TNBC患者免疫治療效果改善相關

6.富含膽堿的飲食可通過共生微生物群上調腫瘤TMAO水平
研究FUSCCTNBC隊列中TMAO與代謝前體的相關性發現膽堿水平與TMAO呈正相關(圖6A)。使用富含膽堿的飲食和3,3-二甲基-1-丁醇(DMB)建立小鼠模型中(圖6B)，發現食用富含膽堿的飼料的小鼠腫瘤TMAO水平更高，腫瘤生長速率更低(圖6C和6D)，腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤和功能增加，而這一作用被DMB聯合治療阻斷(圖6E和6F)。說明富含膽堿的飲食可上調小鼠腫瘤組織中的TMAO，并通過增強抗腫瘤免疫抑制腫瘤生長。

圖6. 富含膽堿的飲食可通過共生微生物群上調腫瘤TMAO水平

研究結論
本研究提供了具有共生微生物群影響宿主腫瘤免疫力的能力的新視角，表明微生物代謝物，如TMAO或其前體膽堿，可能代表了一種新的治療策略，以促進免疫治療對TNBC的療效,說明TMAO可能具有增強TNBC中免疫療法療效的臨床潛力。

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