利用微流控毛細管電泳系統進行AAV衣殼蛋白分析助力基因治療藥物研究
重組腺相關病毒有組織特異性高、安全性好、免疫原性低等等優點，目前被作為基因治療中常用的病毒載體。行業內常采用三質粒或二質粒系統進行細胞轉染，進而獲得不同血清型的重組AAV載體。其中Cap基因編碼VP1、VP2和VP3三種衣殼蛋白和組裝激活蛋白。VP1與病毒從體內逃逸有關，對感染性至關重要；VP2對于組裝或者感染必不可少；VP3核心保守序列β-桶結構決定了不同血清型AAV與宿主細胞作用受體的差異，三者組裝成直徑約25nm的二十面體病毒顆粒，形成病毒衣殼，充當病毒基因傳遞載體。
AAV衣殼屬性是影響病毒感染活性和基因轉導的關鍵因素，其比例、鑒別、純度、空殼率影響藥物效能和效價強度。因此在基因治療產品的整個開發過程中，需要對AAV衣殼的結構、性質及其蛋白質組成進行充分表征和監測，為確保藥物的安全性和有效性。ELISA、免疫印跡法常用于確定功能和組成信息，但是無法做到AAV衣殼蛋白的表征。SDS-PAGE和銀染常用于衣殼蛋白研究，但是檢測時間較長，且常常發生凝膠過熱、過載、染色/脫色標準化不足等問題，導致實驗結果的誤差，檢測通量不大。此外，分析型超速離心方法（AUC）方法和質譜方法也被用于VP蛋白分析，但分析通量有限。因此，行業內亟需尋找一種高通量、準確、靈敏的方法，用于衣殼蛋白組成、純度、比例及糖基化等表征。
PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛細管蛋白分析系統配套ProteinEXact芯片和試劑盒被廣泛用于AAV衣殼蛋白分析。65秒內運行150 nl樣品即可完成樣品分析。靈敏度比銀染靈敏度高一個數量級，可低至0.2ng/uL。作為一種全自動和高通量的檢測方法，為AAV顆粒質量研究帶來了一種定量和可重復的方法。其檢測原理是：帶電荷樣品在電場中遷移，結合的熒光基團會被LIF檢測器檢測。一張芯片整合了SDS-PAGE的所有流程：上樣，分離、染色、脫色和檢測，直接從96 孔板或384孔板采樣，通過軟件即可快速實現蛋白或核酸分析，使用方便且可無人值守，化繁為簡，同時保證檢測通量和數據質量，具有準確定量研究AAV蛋白的潛力。是一種快速、定量且可重復的AAV分析替代方案，目前已用于蛋白分子量、純度、比例和穩定性分析、糖基化以及AAV血清型分析等等。
衣殼蛋白純度、比例研究
實驗人員使用PerkinElmer LabChip GXII Touch系統對AAV8衣殼蛋白進行了定量分析，并對VP1、VP2、VP3和雜蛋白大小、分布、濃度和含量百分比進行了計算。該結果可以與文獻報道的純化樣品SDS-PAGE銀染結果進行了直觀比較。
那么，該系統檢測重復性如何呢？在對同一樣品進行12次重復實驗后發現，該系統對VP1、VP2、VP3檢測具有良好重復性。取12次實驗的VP1、VP2和VP3濃度的平均值，比值為1:1.7:11.3，與預期比例1:1:10接近。
AAV血清型分析
通過對VP1、VP2和VP3峰的分析，還可以用于AAV血清型確認。實驗中前處理必須確保衣殼蛋白完全解離，以便于血清型分析。基于各種血清型AAV的VP分子量大小和組成差別，可以通過LabChip GXII系統，對AAV2、AAV5、AAV8血清型進行了良好的區分。
穩定性及聚體動態研究
AAV衣殼蛋白解離溫度不同，因此AAV的穩定性也不相同。在對AAV2、AAV8和AAV9的空殼研究實驗中，樣品加入SDS80℃反復加熱充分破壞衣殼，使用PerkinElmer LabChip GXII毛細管電泳系統分析發現完全解離的AAV8顆粒有三個峰，部分破碎的衣殼可以形成不同蛋白質分子量聚集體：單體，二聚體，三聚體等混合物以及完整顆粒。該系統的檢測時效性和通量可以為衣殼解離或組裝動態研究提供了極大的便利和數據支撐。
AAV糖基化分析
衣殼蛋白的翻譯后修飾對病毒感染嗜性和免疫原性有較大的影響。在以上峰圖中也可以清楚看到了VP3的“肩峰”，這個跟文獻報道一致，Sara等也發現了AAV2衣殼蛋白的糖基化，并推測了衣殼蛋白表面的四個糖基化位點。為了證實該推測，研究人員對AAV2，AAV8和AAV9衣殼蛋白進行了PNGaseF酶切去糖基化。結果顯示去糖基化前后的確有分子量變化，處理前分子量VP1、VP2、VP3分別為115kDa、94kDa、81kDa，處理后為113kDa、92kDa、79kDa，大約減小2kDa，與附著在衣殼蛋白上的聚糖的平均分子量一致。凝膠圖上酶切前后分子條帶也顯示了位移。Aloor等的報道在AAV8中發現了多個N-糖基化位點，質譜分析鑒定到了N499位點N-糖基化。Mary等對AAV中多種PTM修飾及糖基化位點進行了匯總。
以上，我們介紹了使用PerkinElmer LabChip GXII Touch 微流控蛋白分析系統搭配ProteinEXact芯片和試劑盒進行AAV樣品的分析檢測，證明了該平臺提供病毒蛋白全面分析的能力，可以為重組病毒顆粒衣殼蛋白組成、比例、純度、糖基化分析提供了一套重復性高和精確度好的表征新方法，還為AAV血清型鑒定提供了一種可靠的方法。
在PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛細管蛋白質分析系統上使用ProteinEXact檢測方法，可以實現靈敏度高、重復性好的蛋白質定量和分子量檢測。非常適合于對檢測精度有較高要求的生物制藥上下游樣品分析，以及和基因治療樣品的高分辨率、可對AAV屬性進行重復性、高通量的表征。此外，該方法還可以用于雙特異性抗體表征分析，這個應用我們下一期再來繼續聊。
PerkinElmer LabChip GXII Touch系統特點
- 標準化、高質量的數字數據，重現性好
- 快速高效：1分鐘以內，比普通CE快45-70倍
- 可應用于多個環節：表達體系/條件的篩選、純化過程的優化、劑型、生產過程及產品放行
- 可提供多方面的定量數據：濃度、純度、糖型、聚集體、電荷異質性等等
- 符合相關法規要求
- 領域內的權威用戶已采用并給予高度評價
ProteinEXact芯片和試劑盒特點
- 芯片可重復使用
- 最低上樣量2uL
- 片段大小準確性高：＜2%
- 片段大小分辨率高：±10%分子量差異
- 靈敏度高：0.2ng/μL
- 樣品分析時間短：65 sec
