阿爾茨海默病(AD)是一種廣泛的神經退行性腦疾病，它影響著全球約4400萬人。雖然目前對AD的特征有了一定的了解，但多種分子和細胞變化機制仍不清楚。

最近，在細胞間發揮通信作用的細胞外囊泡(EV)正成為一種新的疾病治療熱點。已有研究表明，從腦組織和生物液體中分離出來的EV在AD中發生了改變，因此，從患者的生物體液或活檢樣本中捕獲細胞類型特異性EV，并對其進行分析，成為研究AD的一種新方法。

2022年，來自哈佛醫學院的研究團隊在Journal of Extracellular Vesicles（IF 21.224）發表了一篇題為“Human neural cell type-specific extracellular vesicle proteome defines disease-related molecules associated with activated astrocytes in Alzheimer's disease brain”的研究論文。文章利用labelfree蛋白組學和TMT蛋白組學研究了不同細胞類型中的EV的蛋白質組譜并鑒定出新的細胞類型特異性EV蛋白標記物，同時證明了細胞類型特異性EV在AD進展中發揮的重要作用，并可作為AD的潛在生物標志物。

研究材料
人類誘導多能干細胞(hiPSC)分化的神經細胞，健康對照、輕度認知障礙患者和阿爾茲海默癥患者的腦組織

技術路線
· 步驟1：人類誘導多能干細胞(hiPSC)分化為四種類型的神經細胞；
· 步驟2：分化的四種神經細胞中提取胞外囊泡（EV）；
· 步驟3：四種神經細胞EV蛋白質組的比較分析；
· 步驟4：細胞類型特異性EV中標志蛋白的確定；
· 步驟5：人類腦組織中分離的EV的蛋白質組學分析；
· 步驟6：細胞類型特異性EV蛋白共表達網絡的構建；
· 步驟7：M7模塊與激活的星形膠質細胞來源的EV和AD病理的相關性分析。

研究結果
1. 人類誘導多能干細胞的分化及分化有效性確認
作者首先用人類誘導多能干細胞(hiPSC)分化成四種神經細胞類型：星形膠質細胞、小膠質細胞、神經元和少突膠質細胞（圖1a），并通過RT-PCR和功能實驗進行分化有效性的驗證（圖1b-1f）。其次，采用非標記定量蛋白組學（label free）的方法對四種類型的細胞進行蛋白質譜分析，共鑒定到3206個蛋白（圖1g），組學結果發現四種分化神經細胞分別對應的細胞類型特異性蛋白標志物的表達量均比較高，這進一步證明了hiPSC細胞分化的有效性（圖1h）。

圖1 hiPSC分化及分化有效性確認

2. hiPSC分化的神經細胞中分離胞外囊泡并進行表征
作者從hiPSC分化的的四種類型的神經細胞中分離胞外囊泡(EV)，使用NTA和TEM方法進行表征分析證明EV的純度（圖2a-2c）。針對胞外囊泡的非標記定量蛋白組學（label free）實驗，發現非EV的蛋白未在EV中檢測到，進一步證明了分離的EV的高純度（圖2d-2e）。同時根據質譜結果，作者篩選到了16個在四種分化神經細胞中均同時表達的蛋白，即烯醇酶1（ENO1）、熱休克蛋白（HSPA8）、Ras相關蛋白（RAB7A）、整聯蛋白ITGB1、膜聯蛋白(含ANXA1、2、5、6)、基礎免疫球蛋白（BSG）、一類過氧化物酶（含PRDX1、2）、前列腺素F2受體負調節因子（PTGFRN）、皮離蛋白（DCD）、CD59和ACTB、GAPDH（圖2g）。

圖2 hiPSC分化的神經細胞中分離胞外囊泡

3. 神經細胞類型特異性EV蛋白質組的比較
為了確定四種神經細胞分離的胞外囊泡蛋白組成的差異，作者比較了囊泡蛋白的豐度，PCA和相關系數結果顯示不同EV蛋白組成具有細胞類型特異性（圖3a-3b）。根據聚類分析結果篩選到了不同細胞類型特異性的差異表達EV蛋白（圖3c）,他們參與了不同的生物過程（GO_BP）和KEGG通路（圖3d），如星形膠質細胞特異的EV蛋白主要富集在與細胞外基質相關的生物學過程（包括細胞粘附、細胞外基質(ECM)受體相互作用和整合素介導的信號轉導）以及生物代謝相關通路（包括糖酵解、丙酮酸代謝過程、膽固醇穩態、氨基酸的生物發生和碳代謝）。

圖3 hiPSC分化的細胞類型特異性EV蛋白組的比較分析

4. hiPSC分化的細胞類型特異性EV中標志蛋白的確定
由于EV蛋白在不同的hiPSC分化神經細胞中具有細胞類型特異性，故作者進一步篩選特定的特異性蛋白作為腦源EV的細胞類型特異性生物標記物。通過初步篩選（圖4a-b）和驗證實驗(圖4c-4d)，最終確定將NCAM1, ATP1A3作為神經元EV的標志物, LRP1, ITGA6, EAAT1作為星形膠質細胞EV的標志物, LCP1作為小膠質細胞EV的標志物, LAMP2, FTH1和 MOG 作為少突膠質細胞EV標志物。

圖4 細胞類型特異性EV中標志蛋白的鑒定

5. 人類腦組織中分離的胞外囊泡的蛋白質組學分析
為了加強蛋白組學的研究發現以及探索其潛在的臨床應用，作者對30個人（包括11名健康對照(HC)、8名輕度認知障礙患者(MCI)和11名AD患者）的腦組織EV進行了TMT標記定量蛋白組學分析（圖5a），共鑒定到4286個腦源性EV蛋白（其中2645個為共有蛋白），差異比較分析篩選到242個顯著改變的蛋白（圖5c）。此外，作者篩選到了多個疾病特異性差異表達蛋白，為區分從HC、MCI和AD大腦中分離出來的EV提供了可能（圖5e）。

圖5 30例人腦組織中分離出的EV的蛋白組學分析

6. 細胞類型特異性的EV蛋白共表達網絡的構建
已知WGCNA(加權基因共表達網絡分析)可用于確定神經退行性疾病相關的關鍵分子途徑和潛在治療靶點，作者利用2645個共有蛋白構建了一個AD EV的WGCNA共表達網絡（圖6a）并將其與AD的三個神經病理特征（臨床癡呆、斑塊負荷、神經纖維纏結負荷）進行關聯分析，結果表明M7模塊（與質膜的固有成分相關）與AD病理特征成正相關 (圖6b）。
進一步對細胞類型標志物在每個共表達模塊中的富集情況進行分析，發現在M7模塊顯著富集星形膠質細胞EV標記物，且與AD性狀顯著正相關，意味著星形細胞來源的EV蛋白標志物或許可作為AD的生物標志物（圖6c）。此外，作者還根據疾病狀態測量模塊特征蛋白值預測可能影響MCI到AD變化的EV蛋白（圖6d）。

圖6 腦源EV蛋白共表達網絡的構建

7. M7/星形膠質細胞模塊在激活的星形細胞來源的EV標記物中富集，并與AD病理相關
上述結果可以看出M7模塊表現出與AD特征（圖6b）和星形膠質細胞來源的EV的關聯性最強（圖6c），作者進一步驗證了M7模塊是否與激活的星形膠質細胞來源的EV相關。結果顯示M7模塊在有活性的星形膠質細胞來源的EV中顯著富集（此部分定義為M7/星形膠質細胞模塊）（圖7a），且與前10個中心蛋白（與AD癥狀相關）發生密切的相互作用（圖7b）。此外，為了進一步驗證來自M7星形細胞模塊的EV蛋白是否與AD病理相關，作者利用IP實驗在5名HC和5名AD患者中驗證了活性星形膠質細胞來源的EV標志物與M7模塊中的中心蛋白(ITGB1)的相互作用（圖7e-7g）。上述結果表明在AD發病機制中，M7星形膠質細胞模塊中的EV蛋白共表達網絡發揮主導作用，鑒定出的M7 EV蛋白(如ITGB1)，特別是在星形細胞特異性EV中，可作為潛在的AD生物標志物。

圖7 M7模塊在激活的星形膠質細胞來源的EV標記物中富集，并參與AD病理過程

小編小結
在本研究中，作者使用labelfree非標記定量蛋白組學方法分析了hiPSC來源的四種不同神經細胞類型(neuron、iAstrocytes、iMGL和iOligos)中分離出的胞外囊泡（EV）的蛋白質譜。利用這些獨特的蛋白質組數據集，共鑒定出16種通用蛋白作為新的腦泛EV標志物候選蛋白。對神經細胞類型特異性EV蛋白進行表征，這些蛋白可作為腦細胞類型特異性EV分離的潛在標記物。此外作者使用TMT標記定量蛋白組學對AD、MCI和HC腦源性EVs進行分析，并結合WGCNA的方法利用細胞類型特異性EV蛋白生成了AD腦源性EV蛋白共表達網絡。

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