Food Chemistry (IF 7.514):植物代謝組學助力藍莓生物活性物質的研究
藍莓因其良好的口感和眾多健康益處而被認為是全球最受歡迎的水果之一，其具有潛在的抗癌、抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗糖尿病等生物功能，這些功能的發揮與生物活性代謝物密切相關。基因型多樣性、環境條件、果實發育階段以及這些因素之間的相互作用等會影響果實的生物活性化合物和代謝物的自然積累模式，而現有的研究主要集中在少數基因型/品種中的總代謝物含量或目標特異性代謝物分析。
2021年11月，佛羅里達農工大學Protiva Rani Das團隊在Food Chemistry（IF 7.514）上發表了題為“Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity”的文章。該文研究了八個藍莓品種在三個發育階段的總代謝物含量、抗氧化性、抗癌活性，并對其中兩個差異顯著的品種進行了非靶向代謝組分析，篩選出與抗癌潛力相關的生物標志物，為開發具有卓越果實品質和營養價值的新藍莓種質提供了見解。
2021年11月，佛羅里達農工大學Protiva Rani Das團隊在Food Chemistry（IF 7.514）上發表了題為“Diversity in blueberry genotypes and developmental stages enables discrepancy in the bioactive compounds, metabolites, and cytotoxicity”的文章。該文研究了八個藍莓品種在三個發育階段的總代謝物含量、抗氧化性、抗癌活性，并對其中兩個差異顯著的品種進行了非靶向代謝組分析，篩選出與抗癌潛力相關的生物標志物，為開發具有卓越果實品質和營養價值的新藍莓種質提供了見解。
研究材料
藍莓果實
技術路線
· 步驟1：不同藍莓品種在整個發育階段的總代謝物含量和抗氧化活性研究；
· 步驟2：藍莓提取物的抗癌活性研究；
· 步驟3：代謝組學分析；
· 步驟4：生物標志物的篩選及其與抗癌活性的相關性研究。
研究結果
1. 不同藍莓品種在整個發育階段的總代謝物含量和抗氧化活性研究
通過測定藍莓果實每個發育階段（第 I階段：綠色；第II階段：轉向色素沉著；第III階段：成熟）的總酚含量（TPC）、總黃酮含量（TFC）、總花青素含量（TAC）、DPPH自由基清除活性和FRAP抗氧化活性，確定藍莓品種的總代謝物含量和抗氧化活性。結果發現在藍莓品種之間以及在每個品種的不同發育階段存在顯著差異。如在整個發育階段，TFC 的積累模式與 TPC 的積累模式相似，即與階段-II 和-III 相比，大多數品種發育階段-I具有顯著更高的總酚含量和類黃酮含量。與其他品種相比，“Vernon”和“Alapaha” 品種具有更高的TPC 值和TFC 值。而花青素的積累主要發生在成熟期，其中“Vernon”品種的TAC 水平顯著高于其他品種。通過 DPPH 和 FRAP 測定確定藍莓提取物的抗氧化潛力，發現不同品種和不同發育時期的抗氧化活性的差異與總酚和總黃酮含量的變化相關（圖1）。
圖1 不同藍莓品種在不同發育階段的(A)表型、(B) 總酚含量 (TPC)、(C) 總黃酮含量 (TFC)、(D) 總花青素含量 (TAC)、(E) DPPH 自由基清除活性和 (F) FRAP 活性研究
2. 藍莓提取物的抗癌活性研究
文章測定了不同品種和發育階段的藍莓在250、500、750 和 1000 ng/mL 四種不同提取物濃度和24、48 和 72 小時三個培養時間對人肺癌 A549、肝癌HepG2 和結腸癌 Caco-2 細胞系的抗癌活性。結果發現藍莓提取物顯示出抑制所有三種癌細胞群的潛在功效，且提取物的抗癌活性與劑量和培養時間有關。統計分析發現最高的抗癌潛力與“Vernon”、“Alapaha”品種有關。根據代謝物含量和營養價值篩選出最高（“Vernon”）和最低（“Star”）藍莓品種，進一步研究發現“Vernon”對癌細胞有更強的抗癌活性，且發育階段-I比階段-II和-III具有更高的抑制癌細胞生長的潛力。“Vernon”在抑制癌細胞群方面的更高效力可能是由于其具有較高生物活性代謝物含量 (圖2)。
文章測定了不同品種和發育階段的藍莓在250、500、750 和 1000 ng/mL 四種不同提取物濃度和24、48 和 72 小時三個培養時間對人肺癌 A549、肝癌HepG2 和結腸癌 Caco-2 細胞系的抗癌活性。結果發現藍莓提取物顯示出抑制所有三種癌細胞群的潛在功效，且提取物的抗癌活性與劑量和培養時間有關。統計分析發現最高的抗癌潛力與“Vernon”、“Alapaha”品種有關。根據代謝物含量和營養價值篩選出最高（“Vernon”）和最低（“Star”）藍莓品種，進一步研究發現“Vernon”對癌細胞有更強的抗癌活性，且發育階段-I比階段-II和-III具有更高的抑制癌細胞生長的潛力。“Vernon”在抑制癌細胞群方面的更高效力可能是由于其具有較高生物活性代謝物含量 (圖2)。
圖2 藍莓提取物的癌細胞生長抑制活性研究
3. 代謝組學分析
作者基于所有發育階段的總代謝物含量、抗氧化能力和抗癌活性的研究，選擇了兩個最具代表性的品種，“Vernon”和“Star”進行非靶向代謝組學檢測。共鑒定出 328 種代謝物，主要是有機酸、脂肪酸、類黃酮、類異戊二烯和單糖。基于代謝物集富集分析(MSEA)，發現p值較高的主要化學基團為氨基酸和多肽、脂肪酸和共軛物、三羧酸、有機羧酸等（圖3）。PCA 分析表明，藍莓代謝物的差異主要是由于品種之間的差異，而在較小程度上是由于發育階段的差異。接著在每個發育階段的兩個品系之間進行火山圖分析，以確定藍莓代謝物的倍數變化差異。發現三種常見代謝物表阿福豆素-3-沒食子酸酯、苜蓿酸和柚皮苷在“Vernon”的每個發育階段都顯著上調。此外，在不同發育階段如山柰酚、十三烷酸、槲皮素3-阿拉伯糖苷等被確定為通常上調的代謝物。相比之下，沒食子酸、曲酸、2,5-呋喃二甲酸、5-羥基-2-糠酸等物質是在每個發育階段發現的常見下調代謝物（圖4）。
圖3 代謝物集富集分析 (MSEA)
圖4 PCA和柱形圖分析（展示火山圖前20種 FC 代謝物模式）
4. 生物標志物的篩選及其與抗癌活性的相關性研究
通過偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)篩選出整個發育階段總共 17 種藍莓生物標志物(VIP ≥ 1.0)，包括奎尼酸、甲基琥珀酸、檸檬酸、草乙酸、蘋果酸等。進一步將鑒定的生物標志物和抗癌活性進行熱圖分析，發現藍莓代謝產物的相對含量和抗癌潛力在不同品種間存在明顯的差異，與“Star”相比，“Vernon”品種具有更高的抗癌活性可能是由于其所鑒定的生物標志物含量更高（圖5）。作者進一步對 17 種生物標志物的抗癌活性進行了相關性分析，結果篩選出5種具有較高抗癌潛力的代謝物，包括綠原酸、氧代己二酸、奎尼酸、甲基琥珀酸和蘋果酸，同時發現“Vernon”品種在每個發育階段包含的每種生物標志物的相對含量顯著較高（圖6）。
圖5 生物標志物篩選及與抗癌活性的熱圖展示
圖6 生物標志物的篩選及其與抗癌活性的相關性分析
小結
文章對不同品種不同發育階段的藍莓果實進行了總代謝物、抗氧化活性、抗癌潛力和非靶代謝組研究，發現藍莓提取物之間的差異主要來源于品種差異。結果還證實了與發育階段-II 和-III 相比，發育階段 I的藍莓果實含有更高的酚類物質和類黃酮含量以及更高的抗氧化和抗癌活性。多元統計分析確定了五種與抗癌活性呈較高正相關的生物標志物包括奎尼酸、甲基琥珀酸、綠原酸、氧代己二酸和蘋果酸。本研究中鑒定的生物標志物及其證明的抗癌活性預計對食品、制藥、營養保健品等領域具有重要價值，有望開發具有抗癌潛力的新種質。
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