三代全長16S/18S/ITS擴增子測序的介紹
三代微生物多樣性是基于PacBio SequelⅡ測序平臺，利用單分子實時測序的方法，對原核生物16S的全部V1-V9可變區域或真核生物的18S高變區域或ITS區域進行全長擴增，不僅能提高物種鑒定的分辨率，還能提高樣本中微生物組成鑒定的精確度，從而更全面的反應微生物的群落結構。
一、PacBio測序原理
利用與二代測序相同的邊合成邊測序的原理，以SMRT芯片為載體；模板與特殊聚合酶結合后，4種不同熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）通過布朗運動隨機進入檢測區與聚合酶結合，按DNA模板序列延伸；通過檢測單個DNA分子的合成所產生的信號來進行測序，也可通過檢測相鄰兩個堿基的測序時間，來檢測一些堿基修飾情況。
圖1. PacBio測序原理[1]
二、產品優勢于二代測序只能獲取1~2個高變區短讀長序列而言，三代測序能一次性測到所有高變區，同時也可以避免不同引物帶來的偏好性，從而提高微生物群落的分類學分辨率。
1.更長讀長，更高準確率[2]
圖2. 測序長度和準確度
2.更高的物種鑒定分辨率和精確度[3]
圖3. 物種鑒定結果
3.更準確的還原微生物群落[4]
圖4. 微生物群落分布
三、技術路線
圖5. 技術流程圖
四、案例分享文章標題：三代全長微生物多樣性研究母嬰微生物群[5]
研究小結：早期微生物與成年后疾病的發生發展有一定的關系，研究發現子宮、胎便、羊水和胎盤都有微生物存在，那么嬰兒胎便微生物來源與母體不同來源的樣本的關系如何呢？本文以39對母嬰的產婦樣本（羊水、糞便、陰道分泌物和唾液）和嬰兒胎便樣品為研究對象，基于PacBio三代全長測序技術進行16S rRNA檢測。檢測發現不同類型樣本間α多樣性和β多樣性存在特異性；同時除發現不同類型樣本各自的一些優勢菌（其中羊水和陰道分泌物的優勢菌為Lactobacillus和Curvibacter，胎便的優勢菌為Bacillus 和Escherichia/Shigella，產婦糞便的優勢菌為Bacteroides和Faecalibacterium，產婦唾液的優勢菌為Streptococcus和Prevotella）外，還發現了他們間共有OTUs，其中胎便菌群與羊水菌群的共有OTUs多于產婦糞便菌群和陰道菌群，由此推斷羊水菌群相比其他位點貢獻更大。此外，發現剖腹產和順產胎兒的胎便和羊水微生物群落結構無顯著差異。
圖6. 文章部分結果
參考文獻：
[1] Mohit K Midha, Mengchu Wu , Kuo-Ping Chiu. Long-read sequencing in deciphering human genetics to a greater depth. Hum Genet . 2019 Dec;138(11-12):1201-1215.[2]PacBio. 2022. PacBio Sequel Systems-PacBio.[online]Availableat: [Accessed 14 February 2022].
[3] Jethro S Johnson, et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nat Commun. 2019 Nov 6;10(1):5029.
[4] Esther Singer, et al. High-resolution phylogenetic microbial community profiling. ISME J.2016 Aug;10(8):2020-32.
[5] Qiuwen He, et al. The meconium microbiota shares more features with the amniotic fluid microbiota than the maternal fecal and vaginal microbiota. Gut Microbes. 2020 Nov 9;12(1):1794266.
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