對于疾病研究，生物標志物（Biomarker）是指可供客觀測定和評價的一個普通生理病理或治療過程中的某種特征性的生化指標，通過測定可以獲知機體當前所處的生物學過程中的進程。檢查一種疾病特異性的生物標志物，不僅可從分子水平探討發(fā)病機制，而且在準確、敏感地評價早期、低水平的損害方面有著獨特的優(yōu)勢，可提供早期預警、預后療效分析、疾病精準的分期分型依據(jù)等。尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的生物標志物已經(jīng)成為目前研究的一個重要熱點。

蛋白質(zhì)是執(zhí)行生物學功能的活性生物大分子，和傳統(tǒng)方法相比，蛋白質(zhì)組學能夠更直接地鑒定到病人和正常人之間差異表達的蛋白，成為發(fā)現(xiàn)生物標志物的重要途徑。

今天隨小希一起學習一種外泌體蛋白組學常見研究模式——通過蛋白質(zhì)組學尋找疾病發(fā)生發(fā)展的新型標志物。

案例：阿爾茲海默癥潛在非侵入性早期生物標志物鑒定—外泌體蛋白質(zhì)組學分析
 
研究背景

阿爾茲海默癥（AD）是常見的老年性疾病，是一種不可治愈的神經(jīng)退行性疾病。患者大腦中會出現(xiàn)淀粉樣蛋白斑塊沉積，這些沉積物能破壞腦神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)與功能，導致神經(jīng)細胞死亡和認知功能喪失。阿爾茲海默癥在β-淀粉樣斑塊沉積發(fā)生之前，識別候選生物標志物對于AD的早期干預具有重要意義。

樣本來源

5XFAD小鼠及同窩對照小鼠的尿液樣本。5XFAD小鼠攜帶5個家族性基因突變的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型，該小鼠重現(xiàn)了阿爾茲海默癥淀粉樣蛋白病理的主要特征，可作為研究AD發(fā)病機制、治療靶點及治療藥物的動物模型。

技術(shù)方法

蛋白質(zhì)組學、生物信息學分析、多反應監(jiān)測（MRM）、WB（Western blot）、ELISA。

研究目的

研究1月齡（β-淀粉樣斑塊沉積前）的小鼠模型與對照小鼠尿液外泌體蛋白質(zhì)組，探討潛在AD早期生物標志物。

技術(shù)路線
研究內(nèi)容

STEP1
樣本收集


收取5XFAD小鼠及同窩對照小鼠的尿液樣本，分離提取外泌體。

STEP2
外泌體鑒定


NTA粒徑濃度分析：對照組和5XFAD組的尿液來源外泌體進行NTA定量分析，其外泌體的平均直徑分別為120.8±43.0 nm和103.2±34.1 nm 。5XFAD組尿液來源外泌體平均直徑小于對照組，但5XFAD組尿液外泌體濃度高于對照組。
TEM電鏡驗證外泌體形態(tài)：呈扁平球形或圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)。
WB驗證外泌體標志物表達：檢測到外泌體跨膜蛋白：CD10、CD63和Flotillin 1；細胞溶質(zhì)蛋白：Alix和TSG101。另外白蛋白是用于評估尿液對外泌體的影響即外泌體純度。實驗表明，從尿液中分離的外泌體相對均一，沒有尿液污染，并且含有外泌體特異性標記。
 
STEP3
蛋白質(zhì)組學研究


差異蛋白篩查
外泌體蛋白質(zhì)進行LC-MS/MS定性和定量分析，5XFAD組和對照組之間的88種尿液外泌體蛋白存在顯著差異。與對照組相比，53種蛋白表達上調(diào)（比率≥1.2，P值<0.05），27種蛋白表達下調(diào)（5XFAD組為0.83，P值<0.05）。

聚類分析顯示了具有相似表達譜的不同層次蛋白質(zhì)簇，18種蛋白質(zhì)是5XFAD組所特有的。相反，在對照組中僅發(fā)現(xiàn)一種獨特的蛋白質(zhì)。在這些差異表達的蛋白質(zhì)中，11種蛋白質(zhì)也是大腦中的細胞標志物，并被選作進一步研究。具體而言，至少有30種蛋白質(zhì)被報道與AD的病理機制或發(fā)展相關，而6種被確定為AD生物標志物并且有很大潛力被認為是AD的候選尿液外泌體生物標志物。
蛋白質(zhì)組學聚類分析和GO分析比較, 根據(jù)差異表達蛋白和尿液外泌體無偏聚類分析，對差異表達蛋白質(zhì)進行GO餅圖分析，以研究對照組和5XFAD小鼠樣本之間的特定MFs、BP和CCs，并根據(jù)不同GO術(shù)語確定的基因數(shù)量進行比較。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析驗證差異蛋白
根據(jù)定性和定量分析，在5XFAD組和對照組之間，有88種尿液外泌體蛋白存在顯著差異。根據(jù)蛋白質(zhì)組學分析的結(jié)果，共選擇22種蛋白質(zhì)進行下一步驗證。為了使靶蛋白之間的關系更加清晰和直觀，進行了22種靶蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡分析和MRM分析。 對照組和5XFAD小鼠靶蛋白的PPI分析和MRM分析，PPI分析顯示了目標差異蛋白之間的關系。兩種蛋白質(zhì)之間的線越多，相互作用的可能性就越大。MRM測定了對照組和5XFAD小鼠之間22種靶蛋白的相對峰面積。

結(jié)果表明：
FUCA2、Ly86、PrP、Annexin 2和Fuca1在兩組之間存在顯著差異。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析驗證22個靶蛋白。與對照組相比，HEXB（溶酶體和/或自噬途徑蛋白）在尿液外泌體蛋白中顯著增加，這與5XFAD小鼠大腦中HEXB的差異表達一致。

另外四種蛋白質(zhì)，AOAH、Clustrin、Ly86和Preol，表現(xiàn)出相同的趨勢，在蛋白質(zhì)組和WB分析中存在顯著差異。與對照組相比，5XFAD組的AOAH水平顯著升高；相反，Clustrin、Ly86和Preol水平明顯降低。
研究結(jié)論

共鑒定出316種蛋白質(zhì)，包括44種腦細胞標志物。重要的是，18種蛋白質(zhì)是5XFAD組所獨有的。共有88種蛋白質(zhì)（包括11種腦細胞標志物）差異表達。WB驗證進一步證實這些蛋白質(zhì)中有5個存在顯著差異。

本研究思路清晰，選擇對照組和模型小鼠樣本，取尿液外泌體樣本，進行蛋白質(zhì)組學分析，獲得差異表達蛋白，然后對篩選的差異蛋白進行驗證，驗證結(jié)果表明一些尿液外泌體蛋白，尤其是Annexin 2和Clusterin能夠檢測淀粉樣β斑塊沉積前的差異，這可能是預防AD的理想非侵入性生物標志物來源。

再回顧借鑒此文研究思路





Dr.Cell實驗室根據(jù)研究者的不同需求，提供差異化的蛋白質(zhì)組學技術(shù)服務以及外泌體整體服務方案。


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參考文獻

Song Z, et al. Comprehensive Proteomic Profiling of Urinary Exosomes and Identification of Potential Non-invasive Early Biomarkers of Alzheimer's Disease in 5XFAD Mouse Model. Front Genet.2020;11:565479.