敗血癥是一種生理、生物學和生化異常的復雜臨床綜合征。它由宿主對感染的失調反應發展而來。肺是最容易感染敗血癥的器官，并可發展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。肺泡 II 型上皮細胞和毛細血管內皮細胞 (EC) 損傷是急性肺損傷 (ALI)/ARDS 發展的主要潛在原因。以往的研究集中于肺泡II型上皮細胞，但越來越多的證據表明肺泡毛細血管EC損傷可能在促進ALI/ARDS進展中發揮更關鍵的作用。

間充質干細胞 (MSCs) 是一個重要的干細胞家族，具有巨大的治療潛力。基于 MSC 的細胞療法由于多種因素，包括多種旁分泌因子的分泌、協助組織修復、免疫調節和減少細菌感染的嚴重程度而成為一種有潛力的治療ARDS的方法。迄今為止，一些臨床研究已經證實了 MSCs 對 ARDS 的治療效果，包括由 2019 年冠狀病毒 (COVID-19) 引起的 ARDS。

近日，由中山大學附屬第一醫院重癥醫學科、轉化醫學研究中心以及中山大學肺部疾病研究所的專家團隊對此領域進行了深入研究。在預實驗中發現，在脂多糖 (LPS) 相關ALI/ARDS動物模型中，用 Ghrelin（生長激素釋放肽）預處理骨髓間充質干細胞 (BMSCs) 可顯著增強其治療效果。肺泡腔滲出液的顯著減少證明了這一點，通過對 Ghrelin 預處理的 BMSCs 上清液的轉錄組測序發現，同源框 B4 (HOXB4) 顯著上調。

HOXB4 是同源盒 (HOX) 基因家族的成員，在細胞更新和分化的調控中具有重要作用。然而，關于 ALI/ARDS 中 HOXB4 與 BMSCs 之間相互作用的研究很少。此外，尚不清楚HOXB4是否能增強BMSCs對ALI/ARDS的治療效果，其潛在的分子機制值得研究。因此，該研究旨在探討 HOXB4 在保護 BMSCs 對抗 ALI/ARDS 中的作用。相關研究成果發表在 Journal of Inflammation Research 題為《Overexpression of HOXB4 Promotes Protection of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Against Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury Partially Through the Activation of Wnt/β-Catenin Signaling》。

實驗結果：

共培養方案在 Transwell 室中建立，上室分別與野生型（WT）BMSCs、BMSCs載體（Vector ）和HOXB4過表達BMSCs孵育，下室與ECs共同孵育。實驗分為五組：對照組、EC+LPS組、BMSC^WT+EC+LPS組、 BMSC^Vector+EC+LPS組、 BMSC^HOXB4+EC+LPS組。

BMSC ^HOXB4共培養促進ECs增殖、遷移和成管能力

EdU 增殖實驗結果顯示，與對照組相比，LPS刺激后ECs的增殖能力明顯降低。與不同組BMSCs共培養后，EC增殖能力顯示差異性增加，與BMSC^WT和BMSC^Vector共培養組相比，BMSC^HOXB4共培養顯著提高LPS誘導損傷后EC的增殖能力（圖1 A、B）。

劃痕實驗結果顯示，LPS刺激后ECs的遷移能力降低，與不同組的 BMSCs 共培養后增加。與BMSC^WT和BMSC^Vector共培養組相比，BMSC^HOXB4共培養組ECs的遷移能力顯著增強（圖1 C、D）。

最后，為了評估 BMSC^HOXB4在體外血管生成中的作用，進行了EC 管形成試驗。如圖1 E，LPS 組幾乎沒有管形成。然而，與BMSC^WT和BMSC^Vector共培養組相比，與BMSC^HOXB4共培養顯著促進EC管形成能力（圖1 F）。
 

圖 1

BMSC^HOXB4共培養減弱 ECs 的凋亡和血管通透性

采用TUNEL 和 AV-FITC/PI 檢測BMSC^HOXB4在 LPS 誘導的 EC 細胞凋亡中的作用。

LPS 刺激后 EC 細胞凋亡顯著增加，TUNEL 陽性細胞的增加證明了這一點；BMSC 共培養表現出不同程度的抗 EC 凋亡；與BMSC^WT和BMSC^Vector共培養組相比，BMSC^HOXB4組顯著降低EC凋亡（圖2 A、B)。同樣，AV-FITC/PI 檢測結果顯示，與 BMSC^WT（凋亡率：44.31%）和 BMSC^Vector（凋亡率： 43.10%) 共培養組相比，BMSC^HOXB4 共培養組的凋亡率（凋亡率：28.62%）顯著降低（圖2 C、D）。

血管通透性是衡量ECs屏障功能的指標之一。因此，我們通過內皮細胞滲漏試驗測量了血管通透性（圖2 E)，發現LPS處理后ECs的通透性顯著增加，與BMSCs共培養后ECs的通透性顯著降低，其中BMSC^HOXB4共培養組的血管通透性顯著低于BMSC^WT和BMSC^Vector共培養組（圖2 F）。
 

圖 2

BMSC^HOXB4共培養通過激活 Wnt/β-Catenin 通路防止LPS 誘導的 EC 損傷

為了研究 HOXB4 對 ECs 保護作用的分子機制，采用蛋白質印跡評估了 β-catenin、VE-cadherin、BAX 和 BCL-2 的表達（圖3 A）。

與LPS和BMSC^WT共培養組相比，BMSC^HOXB4共培養組ECs中β-catenin和VE-cadherin的表達顯著升高；抗凋亡蛋白 BCL-2 的表達顯著增加，而凋亡蛋白 BAX 的表達顯著降低（圖3 B-E）。值得注意的是，與對照組相比，LPS 組中 β-catenin 的表達水平降低（圖3 B），表明 LPS 誘導的 EC 損傷與 Wnt/β-catenin 通路的抑制密切相關。

接下來研究了 BMSC^HOXB4 共培養是否在 LPS 誘導的 EC 損傷中調節 Wnt/β-catenin 通路。研究表明 LPS 誘導的 Wnt/β-catenin 通路抑制被 BMSC^HOXB4 共培養減弱，導致 β-catenin 水平顯著高于LPS 組。相反，Wnt/β-catenin 通路的特異性抑制劑 XAV-939 可逆轉保護作用，伴隨著 BAX 的上調，以及 BCL-2 和 VE-cadherin 的下調。
 

圖 3

炎癥因子的測量

ELISA法測定細胞培養液中炎癥因子的水平（圖 4）。LPS處理后，促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）升高，與 BMSCs 共培養后，IL-1β、IL-6、TNF-α水平存在差異性降低（圖4 A-C）。

與BMSC^WT 相比，BMSC^HOXB4共培養組 IL-6和TNF-α水平顯著降低，而IL-1β的水平在BMSC^HOXB4和BMSC^WT 共培養組中沒有差異。

同樣，LPS刺激后抗炎因子IL-4和IL-10顯著降低（圖4 D、E），與 BMSC^WT 共培養組相比，BMSC^HOXB4 共培養組 IL-10 水平顯著升高，但 BMSC^HOXB4和 BMSC^WT 共培養組的IL-4 水平無統計學差異。

圖 4

實驗結論：

總之，該研究結果表明，LPS 誘導的 EC 損傷歸因于 β-catenin 的減少，而與 BMSC^HOXB4共培養顯然逆轉了 Wnt/β-catenin 信號通路的失活。這表明 BMSCs 可以通過改變 Wnt/β-catenin 信號通路來保護 ECs 免受 LPS 誘導的細胞損傷。而未來需要進一步的體內研究來確定 BMSC^HOXB4 的植入是否可以成為治療 ALI/ARDS 的有吸引力的策略。

參考文獻：Lin S, Chen Q, Zhang L, Ge S, Luo Y, He W, Xu C, Zeng M. Overexpression of HOXB4 Promotes Protection of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Against Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury Partially Through the Activation of Wnt/β-Catenin Signaling. J Inflamm Res. 2021 Jul 27;14:3637-3649. doi: 10.2147/JIR.S319416. PMID: 34349541; PMCID: PMC8326777.

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