提到性狀定位，我們通常會想到大群體、復雜算法、耗資巨大，例如全基因組關聯分析。今天向大家介紹的 BSA 則不同，這種方法不僅材料容易準備、算法原理清晰明了，更重要的是不需要花費高額經費，十分適合性狀初定位。
 

BSA 混池分組分析法簡介

BSA（bulked segregant analysis）混池分組分析法，根據目標性狀表型對分離群體中的個體分別進行分組混合，依據目標性狀的相對差異選擇表型極端的個體分成兩組，然后將兩組的個體或株系 DNA 混合，形成相對的 DNA 混合池。通過在親本和子代混池之間的多態性標記篩選即可完成對目標性狀的定位。

BSA 適用群體

關于性狀定位常用的群體類型有兩種，一種是自然群體（個體間遺傳背景差異較大，通常來自不同地域、不同品種、甚至于不同進化程度的材料），另一種是家系群體（群體遺傳背景較為相似，通常全部來自于兩個親本個體，在目標性狀上有明顯表型分離）。

BSA 采用的是家系群體，常用的家系群體有 F2、BC（n）、RIL、DH 等等。對于家系群體的構建，親本選擇建議：同一物種前提下，目標性狀盡可能差異大的兩個個體。

BSA 原理及分析邏輯
BSA 中通常需要測序 4 個樣本：兩個親本+兩個子代混池

測序拿到原始數據后，可通過質控、與參考基因組比對、SNP calling 等步驟得到各樣本 SNP 標記分型信息。對于重測序而言，無論是 BSA 還是其他性狀定位方法，SNP 分型信息是后續分析的基礎。

接下來如何從海量的 SNP 標記中篩選到與性狀性格的那一部分，進而定位到性狀相關基因是關鍵。對于“雙親健全”（因為實際情況可能只有兩個子代混池）的 BSA 項目來說，是一個三步走策略：

Step 1. 篩選兩親本間純合且差異的標記

家系群體構建時我們知道，首先選擇在目標性狀上差異明顯的個體為親本，表型有差異，跟表型相關的 SNP 標記就一定有差異。在親本之間無差異的SNP可以先篩掉，剩余的親本間純合且差異的這部分再借助子代混池進一步聚焦。
 

Step 2. 子代混池篩選SNP標記并獲得候選區間

標記與性狀進行關聯是性狀定位最核心的部分，對于 BSA 而言，有兩種關聯方法，一種是 ΔSNP-Index，一種是歐式距離（Euclidean distance, ED）。

ΔSNP-Index

SNP-Index可以理解成突變位點遺傳物質來源于某一個親本的頻率，對于混池的某一個位點來說，SNP-Index即為該位點與某親本序列相同的reads占總reads的比例。而Δ SNP-Index即為2個混池之間SNP-Index的差值。滑窗方式計算各區域的Δ SNP-Index，通過置信區間的設置可以判斷區域是否與目的性狀存在關聯。

歐式距離（Euclidean distance, ED）

歐式距離計算將混池中每一個位點的突變信息抽象成坐標上的一個點，并計算混池之間每個相同位點之間的歐氏距離：

ED²=(A1-A2)²+(T1-T2)²+(C1-C2)²+(G1-G2)²

An、Tn、Cn、Gn 分別指 ATCG 四種堿基在混池 n 中的頻率

取所有位點擬合值的 median+3SD 作為分析的關聯閾值，根據關聯閾值判定候選區間。

Step 3. 區間內候選基因注釋及功能富集

篩選 SNP 位點不是目的，關于結果，候選區域更具有生物學意義。確定候選區間后，注釋區間內所包含的基因，并對候選基因集做 KEGG、GO 富集分析。

BSA方案設計
說到方案，主要涉及三個方面：親本測序深度、子代混池樣本數、子代混池測序深度。方案設計是否合理直接關系到結果定位的精度和項目費用。
 

極端混池的樣本數量越多，混池測序深度越高，定位結果精度越高，但同時項目費用也會越高。有學者借助模式植物擬南芥專門針對子代混池樣本數和測序深度對定位結果的影響進行了研究。結果發現，當混池樣本數量達到 20 個，同時測試深度在 20X 以上的情況下，能夠得到相對理想的定位結果。超過這個數量，隨著成本消耗的增加，定位精度的提升效果有限。綜合考慮，通常推薦方案如下：

注：推薦方案不能適用于所有項目，具體方案要根據項目具體情況而定

BSA 結果展示

高通量測序項目的結題報告內容向來比較多，包括各種形式的圖表展示，抓住重點才能讓我們對結果的解讀準確而高效。對于 BSA 而言，要重點關注以下幾個方面：

• 候選區域

• 候選區域內基因注釋

• 基因功能富集

結果細節

< BSA-demo報告 >

BSA 常見問題

Q1：沒有參考基因組的物種可以做 BSA 嗎？

BSA 性狀定位的方法適用于有參考基因組的物種。參考基因組組裝質量好壞以及注釋是否完全對 BSA 結果有一定的影響。建議盡量選擇組裝至染色體水平，且基因組注釋較完全的參考基因組。

Q2：混池樣本如何選擇，一定要到 20 個嗎？

混池的樣本數通常選取極端性狀（群體總樣本數的 5～10% 內）的個體進行混池。混池中若極端性狀個體數太少，可能造成樣品數不夠，不具備代表性；若樣本數過高可能會引入雜合個體，產生干擾。需要根據群體的實際情況，首先保證表型足夠極端，其次考慮樣本數量。不一定必須到 20。例如，某兔子毛色性狀定位研究，通過兩親本雜交、F1 個體混交，得到 35 只 F2 個體，將極端表型控制在 20% 以內，分別選擇 5 只、6 只進行混合，測序深度各為 10X，也得到了較為理想的定位結果。

Q3：影響定位結果的因素？

評估定位結果主要參考候選區域大小和候選基因個數，影響它們的因素包括但不限于兩親本材料的差異大小、家系群體大小及性狀分離情況、子代混池個數、親本及子代混池測序深度、參考基因組水平、目標性狀特點等。

Q4：子代混池構建是先提取在混合還是先混合再提取？

先提 DNA 再等量混合，可以減少系統誤差，近年發表的多數文獻都是先提 DNA 再等量混合。

Q5：BSA性狀定位是否可以采用簡化基因組測序？

簡化基因組捕獲的基因組區域有限，一般僅能捕獲 3%～30%，如果變異的區域正好沒有捕獲到就不能找到目標性狀的基因了。因此用簡化基因組的風險很大，不建議做簡化基因組的BSA性狀定位。

當然要做性狀定位研究，除了 BSA，還有遺傳連鎖圖譜、全基因組關聯分析等經典方案，有任何疑問可聯系技術專家為您免費答疑解惑哦。