• 樣品偶聯方案

以下方案旨在為生物分子與帶有不同表面基團的微球的偶聯提供一般指導。但可能還需要進行優化以實現最佳的活性和穩定性，同時最大程度地減少非特異性結合特性。
A. 羧基修飾的微球試劑：
1. 羧基修飾的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 活化緩沖液（pH 4.5-7.5）*（MES緩沖液是常見選擇）。
3. 偶聯緩沖液（pH 7.2-8.5）[應避免使用含有游離胺的緩沖液，例如Tris或甘氨酸。]
4. 水溶性碳二亞胺（WSC）[例如 EDC，CMC等] **
5. 蛋白質或其他生物分子
6. 用30-40 mM的伯胺源淬滅溶液[例如 羥胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻斷分子
7. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的活化緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。***
2. 第二次洗滌后，將沉淀重懸于10mL的活化緩沖液中，確保微球懸浮良好。 （渦旋，超聲處理或滾動應有助于重懸。）注意：微球懸浮液的濃度現在為10 mg / mL。
3. 混合時，加入100mg的WSC。 （添加WSC可能會導致結塊；通常不會引起太大的關注，應該通過與生物分子孵育來解決[步驟6-7]。）
4. 在室溫（18-25°C）下反應15分鐘，并連續攪拌。
5. 在偶聯緩沖液中洗滌2次，并重懸于5mL的相同緩沖液中。像步驟2中一樣，盡可能確保顆粒被很好地懸浮。
6. 在5mL偶聯緩沖液中溶解蛋白質（超出計算的單層1-10倍）。結合微球懸浮液和蛋白質溶液。
7. 在室溫下持續攪拌2-4小時。
8. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，并輕輕混合30分鐘。洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
9. 存放在4℃直到使用。
* 加入WSC后的反應速率取決于pH（隨著pH降低，反應速率增加）。
**  EDAC或EDC：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
Hydrochloride
CMC：1-Cyclohexyl-2-(2-morpholinoethyl) carbodiimide
Metho-p-toluenesulfonate
備擇方案：
1. 一步耦合反應，即碳二亞胺，蛋白質和微球在一個步驟中結合在一起，對于耦合較大的分子通常是有問題的，但已有效地用于較小的分子（如類固醇和半抗原）的耦合。
2. 可以加入水溶性的磺基-N-羥基琥珀酰亞胺以提高偶聯效率。 由N-羥基化合物形成的活性酯中間體替代由WSC形成的鄰酰基脲脲中間體（不穩定），對水解更穩定，但仍對要偶聯的蛋白質上的胺具有高反應性。
B. 氨基修飾的微球
試劑：
1. 氨基修飾的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 胺反應性同雙功能交聯劑（例如戊二醛，酰亞胺酯或NHS酯。）
3. 洗滌/偶聯緩沖液（pH 6.0-9.0）（請參見第二部分，緩沖液。）
4. 蛋白質或其他生物分子
5. 用30-40 mM的伯胺源淬滅溶液[例如 羥胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻斷分子
6. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗滌/偶聯緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗滌后，將沉淀重懸于10mL戊二醛溶液中（戊二醛溶解在洗滌/偶聯緩沖液中至終濃度10％）*，確保微球完全懸浮。 （渦旋，超聲處理或滾動就足夠了。）注意：微球懸浮液的濃度現在為10 mg / mL。
3. 在室溫（18-25°C）下反應1-2小時，并持續攪拌。
4. 洗滌2次，重懸于5mL洗滌/偶聯緩沖液中，并確保將顆粒完全重懸，如步驟2所示。
5. 在5mL洗滌/偶聯緩沖液中溶解蛋白質（超出計算的單層1-10倍）。結合微球懸浮液和蛋白質溶液。
6. 在室溫下連續攪拌2-4小時。
7. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，并輕輕混合30分鐘。洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
8. 存放在4℃直到使用。
*戊二醛應大量添加，以使微球上的氨基飽和，從而避免在配體連接之前微球之間的交聯。 添加的數量需要優化，因為戊二醛過多可能會改變蛋白質的天然構象，從而降低其生物活性。
備擇方案：
1. 除戊二醛外，各種長度的胺反應性同雙功能交聯劑都可用于形成間隔臂，從而使共價偶聯的蛋白質從表面上以不同的長度引出。
2. 氨基和醛之間形成的鍵形成可逆的席夫堿，必須通過稱為還原烷基化的方法將其還原，以使鍵共價。 常用的還原劑包括氰基硼氫化鈉，胺硼烷和吡啶硼烷。但是，由于每種蛋白質上的幾個氨基都與微球上的醛基相互作用，因此有時認為在偶聯大多數蛋白質時無需還原這些鍵，例如抗體。
C. 羥基修飾的微球
試劑：
1. 羥基改性的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 2 M碳酸鈉（活化緩沖液）
3. 氰化溴化物（CNBr）
4. 乙腈（C₂H₃N）[用于溶解CNBr]
5. 蛋白質或其他生物分子
6. 洗滌/偶聯緩沖液（pH 8.0-9.0）。 （避免使用含胺的緩沖液，如Tris或甘氨酸，它們會與配體競爭偶聯位點。 請參見第二節，緩沖液。）
7. 用30-40 mM的伯胺源淬滅溶液。 （羥胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）的阻斷分子。
8. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗滌/偶聯緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次清洗后，重懸于9.5mL的活化緩沖液中，確保微球完全懸浮。 （渦旋，超聲處理或滾動就足夠了。）
3. 在通風櫥中，將1g CNBr（或1g CNBr：100mg微球的比例）溶解在0.5mL乙腈中。 （警告：CNBr具有很高的危險性，應在通風櫥中使用所有適當的預防措施進行處理。）
4. 將CNBr溶液（滴加）添加到攪拌的微球懸浮液中，并使活化反應在室溫（18-25°C）下精確地持續2分鐘。注意：微球懸浮液的濃度現在為10 mg / mL。
5. 在大量的冰冷水中快速洗滌活化的微球，然后用冷偶合緩沖液洗滌。 5mL冷偶合緩沖液（4˚C）重懸微球。將要偶聯的配體溶解在5mL偶聯緩沖液中，其濃度對應于計算出的單層1-10X過量，結合微球懸浮液和蛋白質溶液。
6. 在持續攪拌下，將懸浮液在4°C下保持24小時。
7. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，并輕輕混合30分鐘。洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
8. 存放在4℃直到使用。
備擇方案：
1. 1-cyano-4-dimethylaminopryidinium tetrafluoroborate可以代替CNBr，因為它是不揮發的，毒性較小的化學藥品，具有較長的半衰期。
2. 也可以使用Tosyl Chloride, Tresyl Chloride or carbonyl diimidazole活化劑代替溴化氰。
D. 酰肼修飾的微球
試劑：
1. 酰肼改性的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 洗滌/偶聯緩沖液（pH 5.0-7.0）
3. 蛋白質
4. 100 mM偏高碘酸鈉（NalO₄）
5. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
A. 蛋白質的氧化（注意：該反應對光敏感，應在黑暗中進行。）
1. 在1mL的洗滌/偶聯緩沖液中溶解或稀釋1-10X過量的計算的單層蛋白質。
2. 將蛋白質溶液添加到含有1mg偏高碘酸鈉的琥珀色小瓶中：20mg蛋白質； 輕輕旋轉以溶解氧化劑。
3. 不斷攪拌下，將樣品在室溫下孵育30分鐘。
4. 通過使混合物通過用偶聯緩沖液平衡的脫鹽柱（例如Sephadex™G25或PD10）終止反應并除去未反應的NalO₄。
B. 偶聯至肼修飾的乳膠微球
1. 在10mL的洗滌/偶聯緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗滌后，將微球重懸于9mL洗滌/偶聯緩沖液中，確保微球完全懸浮。
3. 將9mL的微球懸浮液與1mL的氧化蛋白質懸浮液混合。 （注意：現在濃度為10 mg / mL。）在室溫（18-25°C）下混合至少反應6個小時。
4. 洗滌，重懸于含有0.05-1％（w / v）阻斷分子的10mL洗滌/偶聯緩沖液中，輕輕混合30分鐘。
5. 洗滌，然后重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
6. 儲存在4℃直到使用。
備擇方案：
另一種選擇是使用戊二醛激活微球，使用的方法與氨基修飾的微球相同。​
E. 氯甲基修飾的微球
試劑：
1. 氯甲基改性的微球（通常以10％的固體含量提供）
2. 蛋白質或其他生物分子
3. 洗滌/偶聯緩沖液（pH 7.5）
4. 用30-40 mM（例如羥胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）阻斷分子的伯胺源淬滅溶液。
5. 具有0.01-0.1％（w / v）阻斷分子的儲存緩沖液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗滌/偶聯緩沖液中洗滌1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗滌后，重懸于5mL洗滌/偶聯緩沖液中，確保微球完全懸浮。 （渦旋，超聲處理或滾動就足夠了。）
3. 在5mL洗滌/偶聯緩沖液中溶解蛋白質（超出計算的單層1-10倍）。 結合微球懸浮液和蛋白質溶液。注意：微球懸浮液的濃度現在為10 mg / mL。
4. 在室溫（18-25°C）下持續攪拌2-4小時。
5. 洗滌，重懸于10mL淬滅溶液中，在室溫下輕輕混合30分鐘。
6. 洗滌并重懸于存儲緩沖液中至所需的存儲濃度（通常為10 mg / mL）。
7. 存放在4℃直到使用。
注意：氯甲基微球可以分類為預活化的，因為微球上的氯甲基會直接與可用的氨基反應，而無需任何預處理步驟。 由于這些氯甲基的高反應性，它們會隨著時間的推移在水性懸浮液中脫鹵化氫，因此合成后的保存期限有限。 然而，一旦配體被偶聯，它們的穩定性就與任何其他配體包被的微球的穩定性相匹配。

其它偶聯方案
A. 與非功能化聚合物微球的偶聯

1. 聚苯乙烯（PS）

可以通過四個步驟將生物分子共價偶聯到普通的聚苯乙烯微球上：表面苯乙烯環的硝化； 硝基轉化為芳族胺基； 芳族胺基團的重氮化形成重氮化合物； 并與蛋白質的酪氨酸殘基偶聯。

1. 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）

PMMA微球并未廣泛用于配體的共價偶聯； 然而，甲酯基將容易與肼反應，產生酰肼反應位點。
B. 與非功能化二氧化硅微球的偶聯
已有文獻報道了硅烷化的核酸（寡核苷酸，PCR產物）與未修飾的玻璃表面的偶聯。可以將這種方法進行修飾，以將硅烷化的生物分子與二氧化硅微球偶聯。
C. 表面官能團的轉化
可以將微球上的一個表面官能團轉化為另一個。例如，胺改性的微球可通過琥珀酸酐反應轉化為羧基改性的微球；相反，羧基可通過碳二亞胺介導的二胺的連接而轉化為胺基；巰基改性的微球可通過胺官能化的微球反應制得。這些和其他轉化可用于拓寬各種配體的連接方案。
D. 小分子的共價結合
小分子（半抗原，激素，藥物等）的共價結合可能會帶來特殊的困難，需要創造性的解決方案，例如載體分子和各種類型的交聯劑的組合。 可以使用間隔物/交聯劑從小球的表面延伸小分子，從而減少空間位阻并允許小分子與樣品中的靶分子相互作用。 具有可用表面基團（例如BSA，聚賴氨酸）的載體分子可能被吸附到微球表面，隨后小分子與載體分子的反應基團發生共價偶聯。 或者，可以先將小分子與載體分子共價偶聯，然后將載體/小分子復合物吸附到微球。 然后可以將吸附的載體分子彼此共價連接，以防止它們從顆粒中解吸/丟失。