外泌體lncRNA介導的淋巴轉移機制的揭秘

瀏覽次數：1202　發布日期：2020-3-4　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

文章導讀

外泌體是指包含多種RNA（環狀RNA、miRNA、LncRNA和mRNA等）和蛋白質的盤狀囊泡（30-200nm）。幾乎所有類型的細胞均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于各種體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。外泌體被視為特異性分泌的膜泡，能夠參與細胞間通訊。目前，有關外泌體分泌、攝取、內容物以及相應功能的精確分子機制的研究才剛剛起步，對外泌體的研究興趣也是日益增長。

2020年2月6日，外泌體領域大牛Raghu Kalluri教授在Science雜志（影響因子41.037）發表了關于外泌體的綜述，該綜述介紹了外泌體的生物發生、異質性、以及細胞間通信過程，同時也分析總結了外泌體在哺乳動物的繁殖和發育、神經退行性疾病、代謝和心血管疾病、免疫反應和感染、癌癥以及在臨床診斷和治療應用等領域中的重要價值，激發了該領域的研究熱度。2020年1月2日，The Journal of Clinical Investigation雜志（影響因子12.282）刊登了一篇外泌體lncRNA LNMAT2促進膀胱癌淋巴轉移過程的文章。該篇文章巧妙利用多種技術揭示了外泌體lncRNA介導的淋巴轉移機制，并將LNMAT2作為膀胱癌淋巴轉移的治療靶點。

發表期刊：The Journal of Clinical Investigation
影響因子：12.282
實驗方法：LncRNA-seq、RNA pull-down+MS/WB、RIP、ChIP、雙熒光素酶報告實驗（云序可提供以上服務）
實驗樣本：淋巴轉移膀胱癌組織vs.非淋巴轉移膀胱癌組織（5 vs. 5 ）
文獻鏈接：
https://www.jci.org/articles/view/130892/pdf

文章內容

（1）LNMAT2過表達與BCa淋巴結轉移相關

作者前期通過對5對淋巴轉移膀胱癌組織（LN+）和非淋巴轉移膀胱癌組織（LN-）進行LncRNA-seq（云序可提供此服務）發現，LNMAT2在淋巴轉移膀胱癌（Bca）組織明顯上調；對266名膀胱癌組織進行qPCR，結果顯示LNMAT2在LN+中明顯上調；K-M分析顯示，LNMAT2過表達的膀胱癌病人生存率（OS）和無病生存率（DFS）明顯少于低表達LNMAT2組。這些數據說明LNMAT2過表達可能引起BCa的LN轉移。

圖注：LNMAT2過表達與BCa淋巴結轉移相關

（2）LNMAT2在BCa細胞分泌的外泌體中富集

作者利用ISH實驗發現，在BCa的胞外間隙中有較高的LNMAT2表達（D）；與LN（-）-BCa組織相比，LN（+）-BCa組織中細胞外LNMAT2的表達明顯升高。細胞外lncRNA主要被包裹在特定的亞細胞物質中（特別是外泌體），提示LNMAT2可能被BCa細胞外泌體包裹。為了驗證這一假設，作者從206例BCa患者和120例健康對照組的尿液樣本中分離出外泌體并進行qPCR實驗，發現與健康對照組相比，來自BCa患者的尿液外泌體中LNMAT2表達上調。這提示外泌體LNMAT2對BCa的發生發展有重要意義。

圖注：LNMAT2在BCa細胞分泌的外泌體中富集

（3）BCa細胞分泌的外泌體LNMAT2在體外促進淋巴生成

作者首先對BCa細胞系（5637和UM-UC-3）進行外泌體鑒定；下調/過表達LNMAT2的BCa細胞系外泌體與人淋巴內皮細胞（HLEC）共孵育，血管形成實驗和遷移實驗發現下調LNMAT2能夠抑制HLEC的血管形成和遷移，上調LNMAT2則相反；體內實驗證明，上調LNMAT2能促進淋巴生成。

圖注：BCa細胞分泌的外泌體LNMAT2在體外促進淋巴生成

（4）hnRNPA2B1介導LNMAT2包裝進入BCa細胞外泌體

為了探究LNMAT2的分子機制，作者進行LNMAT2 RNA pull-down+MS（云序可提供此服務）實驗，結果顯示hnRNPA2B1能夠與LNMAT2直接結合；為了驗證MS結果，作者進行LNMAT2 RNA pull-down+WB、RIP+qPCR（云序可提供此服務）實驗，結果顯示LNMAT2確實能夠與hnRNPA2B1直接結合；而且FISH實驗顯示LNMAT2和hnRNPA2B1能夠定位于細胞核；為了探究LNMAT2是如何進入BCa細胞外泌體的，作者在BCa細胞系中敲減hnRNPA2B，發現外泌體中LNMAT2的表達降低。這些結果說明hnRNPA2B1能夠介導LNMAT2包裝進入BCa細胞外泌體。

圖注：hnRNPA2B1介導LNMAT2包裝進入BCa細胞外泌體

（5）外泌體LNMAT2上調PROX1的表達

有研究報道，PROX1通過調節內皮細胞的分化和轉移，對淋巴管系統發育至關重要。因此作者通過qPCR和WB實驗發現，HLECs中上調LNMAT2能夠促進PROX1的表達；為了探究LNMAT2調控PROX1表達的分子機制，作者進行核質分離PCR，發現LNMAT2主要存在于HLECs的細胞核中；為了探究LNMAT2是否參與啟動子區結合，作者針對PROX1上游-2000 bp到下游+200bp分區間進行雙熒光素酶報告實驗（云序可提供此服務），結果顯示PROX1在-650bp到-350bp區間的熒光值明顯升高，說明該區域能夠與LNMAT2結合。

圖注：外泌體LNMAT2上調PROX1的表達

（6）外泌體LNMAT2與hnRNPA2B1互作促進PROX1啟動子區H3K4三甲基化

研究發現，hnRNPA2B1能夠通過與目標DNA結合參與H3K4三甲基化（H3K4me3）相關的表觀遺傳調控。為了探究hnRNPA2B1是否也具有類似功能，作者通過ChIP實驗（云序可提供此服務）驗證，在LNMAT2過表達的HLECs中，hnRNPA2B1與H3K4me3都與PROX1啟動區結合能力增強，反之亦然；這說明外泌體LNMAT2通過與hnRNPA2B1直接互作提高PROX1啟動子中H3K4me3的水平。

圖注：外泌體LNMAT2與hnRNPA2B1互作促進PROX1啟動子區H3K4三甲基化

（7）外泌體LNMAT2誘導PROX1上調促進淋巴淋巴轉移

為了明確PROX1是否為BCa外泌體LNMAT2誘導淋巴管生成所必需的，作者進行了PROX1挽救實驗，發現PROX1過表達能夠回補外泌體LNMAT2過表達導致的抑制HLEC血管形成和遷移現象；相反，PROX1沉默明顯消除了外泌體LNMAT2誘導的HLEC血管形成和遷移現象。

圖注：外泌體LNMAT2誘導PROX1上調促進淋巴轉移

（8）外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結轉移有關

研究證明，BCa細胞分泌的外泌體lncRNA可以在尿液中檢測到，并且這些尿液外泌體lncRNA被認為可以作為早期診斷BCa的生物標志物，作者對另外206例BCa患者尿液外泌體進行qPCR，結果顯示LNMAT2在LN（+）BCa中明顯上調；KM分析顯示尿液外泌體LNMAT2高表達BCa患者的OS 和DFS是降低的；ROC曲線分析顯示尿外泌體LNMAT2可以作為BCa和LN（+）BCa診斷的生物分子標志物。

圖注：外泌體LNMAT2與BCa患者的淋巴結轉移有關

總結

總體來說，該研究通過LncRNA-seq（云序可提供此服務）篩選了在淋巴轉移的膀胱癌中上調的LNMAT2，并通過原位雜交實驗將LNMAT2與膀胱癌外泌體聯系在一起，并巧妙利用了RNA pull-down+MS/WB、RIP、ChIP以及雙熒光素酶報告實驗等方法（云序可提供以上服務），探究hnRNPA2B1介導LNMAT2進入膀胱癌外泌體中，外泌體LNMAT2被人淋巴管內皮細胞攝取內化后，通過募集hnRNPA2B1和增加PROX1啟動子上的H3K4三甲基化水平，進一步上調PROX1表達，最終導致淋巴管生成和淋巴轉移。這為研究和理解生物體復雜的外泌體調控機制，提供了比較完整的實驗研究思路和方案，具有很強的理論先導性和示范性，也為疾病的調控和靶點提供了重要的理論依據。

圖注：膀胱癌外泌體LNMAT2調控淋巴轉移的分子機制

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