TissueFAXS Cytometry技術在新冠肺炎相關方向研究

2月17日，上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院新冠肺炎病因診斷專家組踏上征程。該專家組由國家衛健委委派，赴武漢開展新冠肺炎病理學和病因診斷研究工作。他們的主要任務是進行新冠肺炎病例的病因分析，深入研究疾病發生發展的病理生理過程，并為后續研究提供重要科學支撐。與此同時，全國首批新冠肺炎逝者遺體解剖也已在武漢金銀潭醫院完成。

為什么病理學信息至關重要？

目前，臨床上對于新冠肺炎的了解和認知大都來源于臨床癥狀、影像學、檢驗分析、病毒分析等方面研究。但要真正直觀地了解器官的損傷、如何損傷、體內器官損傷如何相互關聯影響等問題，都需要通過病理學信息來解決。

病理學家指出，「對于新冠肺炎而言，通過病理解剖研究疾病發生機理，有助于幫助臨床糾正可能的錯誤診療方案。此外，超微結構、分子病理等方面研究也可以幫助其他領域的專家做很多事情。」

COVID-19患者的病理學特征 SARS-CoV-2感染患者的雙肺、肝臟及心臟組織病理標本（Zhe Xu, Lei Shi, Yinjin Wang.etal. Pathological findings of COVID-19 associated with acuterespiratory distresssyndrome. Lancet Respir Med 2020）

根據解剖完成的肺組織切片鏡下可見，COVID-19的患者存在彌漫性的肺泡損傷，伴有支氣管上皮剝脫、纖毛脫落、鱗狀上皮化生等病變；以及肺泡壁大量的炎性滲出，導致患者呼吸困難、血氧含量降低。死者大部分肺泡和肺間質巨噬細胞浸潤、肺泡上皮細胞增生，形成雙嗜性胞漿豐富的多核巨細胞。

病理學信息是重大疾病確診的最終診斷標準，組織圖像中細胞不是獨立存在的，而是交織、混雜在一起，同種細胞形態上有時也會存在較大差異，要想做到組織圖像中每個單細胞標記marker的準確量化、準確的單細胞識別是后續量化的基礎。TissueFAXS Cytometry專利的單細胞識別技術，可以做到組織內不同大小、染色強度、形態等差異性非常大的細胞核、質、膜多組分準確識別，保證細胞統計準確性，為后續量化分析奠定了堅實基礎。

TG & COVID-19

奧地利TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry專利技術是一種基于全景組織細胞定量分析系統的圖像處理的病理定量分析技術，能夠實現包括超大尺寸病理切片全景掃描和細胞培養樣本的數字化全息獲取；從亞細胞到組織水平的大數據定量分析；目標細胞/組織/結構空間分布水平數字化定量以及完成從體視學到大數據的雙向獨立、可重復的驗證。 針對新冠肺炎的研究，TissueFAXS Cytometry技術具有極大的應用意義。
 

1. HE／IHC樣本組織：自動對簡單HE染色下肺組織中所有細胞輪廓進行識別，結合自動肺泡/支氣管的組織識別功能，迅速判斷炎性細胞數量、浸潤程度、上皮脫落面積、纖維化程度等指標。
2. IF樣本組織：結合標記特異性蛋白Marker的免疫組化或免疫熒光技術，可以更進一步研究肺組織微環境中浸潤的免疫細胞表型、上皮細胞化生程度等實驗室精準定量指標。
3. 病毒原位研究：利用特異性核酸熒光探針以及免疫熒光技術，共同標記病毒相關蛋白的表面抗原及核酸核心，不但可以從圖像中精準定量病毒在細胞內外的數量及位置 — 建立通中過肉眼可以判斷的病毒載量定量標準，同時分析病毒的增殖侵襲過程和組織的相互空間關系！

TissueFAXS Cytometry技術相關案例1

無標記形態學識別及定量分析肺組織中的支氣管/血管/肺泡
 
通過顏色及形態學參數，在識別肺泡細胞/支氣管上皮細胞/血管內皮細胞/紅細胞的基礎上，對無特殊染色標記的肺組織中支氣管、血管、肺泡的數量/大小/形態進行定量分析。

TissueFAXS Cytometry技術相關案例2

HE染色下自動識別并定量肺腫瘤/血管/炎性滲出區域/正常肺泡區域 根據肺部腫瘤、炎性細胞等組織的顏色及形態學特性，對無特殊染色標記的組織病灶及結構進行識別，并用不同顏色標記以便進行后續的定量分析。

TissueFAXS Cytometry技術支持超大組織樣本切片全景掃描和定量分析，協助科研工作者們突破從分子水平、細胞水平、組織水平直至器官水平的數據瓶頸，分析不同分子/蛋白在不同組織內部及相鄰器官中的數量、形態、類型、分布等信息，從微米尺度到厘米尺度，真正做到100％還原原始樣本！

TG在病毒分子機制研究中的應用發表文章節選

• 流行性感冒和肺炎的分子機制研究 （日本東北大學醫學研究院）

致死性流感肺炎的嚴重程度取決于OX40L表達。由于OX40L能夠與細支氣管肺泡干細胞的流感病毒相結合，流感感染時通過增加細胞數量以介導上皮修復，并誘導其表面的OX40L表達從而刺激免疫反應。然而，宿主的防御反應將會導致更廣泛的感染，最終造成過度的免疫防御反應而致死。
F，G： 對比致死劑量的A / H1N1流感病毒（Flu）和生理鹽水（Mock）氣管內感染的WT小鼠肺細支氣管的免疫熒光樣本，因為CCSP（紅色）和SPC（綠色）雙陽性表達被認為是細支氣管肺泡干細胞的特征，用來反映支氣管肺泡干細胞的存在與否。

由TissueFAXS系統掃描的影像數據進行定量分析得出，甲流病毒的感染使終末細支氣管CCSP免疫反應性細胞的脫落，但CCSP/SPC雙陽性細胞則更多的在遠端支氣管部位出現，修復受損的上皮。

• AXL受體-星形膠質細胞反應相關研究（上海復旦大學附屬金山公共衛生臨床中心）

​ 細胞膜表面分子AXL在寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）染星形膠質細胞的過程中扮演著重要角色，但它并不是ZIKV進入星形膠質細胞的主要受體，AXL分子主要通過STAT1/STAT2通路調控SOCS1分子表達，進而抑制I型干擾素信號應答，最終促進ZIKV在宿主細胞中復制。該研究發現的ZIKV感染神經細胞的新機制，為研發新型有效的ZIKV防御技術提供了生物學新靶點。 b,c：ISH法檢測ZIKV RNA，并對內部的ZIKV RNA進行數據統計分析g,h：AXL基因敲除介導的ZIKV復制能力受到IFNAR1信號通路控制，IFNAR信號依賴機制可以有效保護星形膠質細胞

病毒分離鑒定十分復雜，利用StrataQuest軟件對免疫熒光、原位雜交的掃描圖像進行分析，獨有的細胞質形態識別功能，可以十分清晰的看到病毒的復制數量、作用靶點以及空間分布位置，為明確病毒感染細胞的作用機制提供有效的幫助。

• HIV/SIV及結核病的相關性研究（美國麻省理工學院，哈佛醫學院）

研究人員對人肺組織、人源化小鼠CD4+T細胞以及結核分枝桿菌（Mtb）/ 猴免疫缺陷病毒（SIV）非人靈長類共感染模型中的感染情況進行研究，表明肺實質CD4+T細胞對HIV-1依賴性細胞死亡具有耐受性，而CD4+T細胞在肺間質而不是肺泡腔中的缺失非常顯著，CD4+T細胞的缺失與肺外播散有關，研究還證明了肺間質CD4+T細胞是HIV-1和SIV感染的有效靶點，使得其早期衰竭缺失和播散性肺結核的風險增加。 實驗人員對肺部及脾臟組織的CD4+T IHC切片進行組織原位掃描明確感染部位及CD4+的分布情況并對CD4+細胞進行定量分析，發現CD4 + T細胞高度允許HIV-1誘導的細胞死亡而HIV-1感染不會明顯改變肺泡CD4 + T細胞數量。但是，SIV感染導致肺結核期間間質CD4 +T細胞耗竭并進一步證實出肺間質CD4 + T細胞丟失與播散性結核有關。

嚴謹的科學研究需要客觀、量化的數據支持，針對于肺部等組織免疫細胞的數量關系、空間位置分布情況以及相互作用關系，TissueFAXS Cytometry技術可以提供組織原位精準定量的數據結果，將極大的推動研究者們的科研進展。