蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南十一

瀏覽次數：6539　發布日期：2019-6-26　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

蛋白質組學
蛋白質組學是鑒定和定量細胞、組織或生物體蛋白質的科學，目的是了解生物學變化和疾病狀態，開發疾病的生物標記和治療藥物的靶點。

如果將一個基礎蛋白的各個修飾蛋白算作一個蛋白，那么哺乳動物細胞含多達3~4萬個蛋白。當計算各個修飾后的蛋白時，蛋白質的數量遠遠超過了10萬。
細胞內不同蛋白質的豐度或濃度可能因不同的數量級而變化。
細胞系統的任何變化，如老化、患病或接受藥物治療等均會導致一個或多個蛋白質相對豐度或表達發生變化。
蛋白質組學旨在鑒定細胞系統內的蛋白質，并識別和監測蛋白質的變化，如對蛋白質的修飾（翻譯后修飾）或蛋白質相對濃度的變化。
如果某一事件使蛋白質豐度增加，那么我們就說該事件上調蛋白表達。如果某一事件使蛋白質豐度降低，那么我們就說該事件下調蛋白表達。
受細胞變化影響時，蛋白質豐度可能會發生顯著變化，蛋白質豐度的變化是事件變化的信號。

翻譯后修飾（PTM）是指蛋白質在翻譯后的化學修飾。
PTM包括寡糖鏈的添加（糖基化）、醋酸鹽等含烷基蛋白質N-端的修飾（乙酰化等）、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸上磷酸基團的加入（磷酸化）等相似活動。
磷酸化等PTM活動在很大程度上是臨時性的，用于細胞在細胞內和細胞間信息的傳遞。
糖基化等PTM活動為結構性改變，通常影響蛋白質折疊、與其他分子的相互作用以及與細胞壁的相互作用。
所有這些代表了活細胞內發生的動態變化。

蛋白質組表示細胞內或任何研究樣品中全部的蛋白質。
一個完整的細胞蛋白質組由40000種單個蛋白質組成，具有多達10~20種不同的修飾形式，豐度也因數量級的不同而變化。
蛋白質組學的目標顯然是巨大的，要求最強大的分離和分析技術。

電泳A
為了實現蛋白質的鑒定和/或定量，必須盡可能地將單個蛋白質與其它蛋白質分離。
很多年來，凝膠電泳法均為分離完整蛋白質的初級手段。
雙向凝膠電泳（2DGE）根據蛋白質的等電點（第一向）和分子量（第二向）實現蛋白質的分離（見圖48）。
完整細胞蛋白質組的2DGE相當復雜，且在分離多達2000~3000個蛋白質的同時，很難實現蛋白質間的相互分離，或由于某些蛋白質豐度低而很難在凝膠上看到。2DGE仍是強大的蛋白質分離工具，它是一項發展成熟的技術，具有許多經驗豐富的用戶，能夠實現高分辨率和多種蛋白質的定量。
目前，2DGE的局限性是其不僅耗時而且費力，主要衡量豐度更高的蛋白質，較難實現膜結合蛋白等重要蛋白質的衡量。

圖48. 雙向凝膠電泳可分離出多達2000~3000種單個蛋白質。
每一個斑點代表一個或多個蛋白質。

橫向分離由等電點引起，與電荷有關。

縱向分離由分子量大小引起（SDSPAGE）。
分子量較小的蛋白質移到凝膠底部，而分子量較大的蛋白質留在凝膠頂部。

色譜分析
色譜技術已發展成一種強大的分離技術，能夠分離大量蛋白質和多肽。
但任何一種單獨的色譜技術仍然只能分離出一小段蛋白質。
因此，多種色譜技術的結合使用已成為蛋白質組分析中蛋白質分離的一種普遍方法。

二維色譜
在長期的蛋白質純化模式的基礎上，John Yates和同事開發了一種名為多維蛋白質鑒定技術（MudPIT）的蛋白質組分析技術。
在該技術中，采用胰蛋白酶等蛋白水解酶首先將蛋白質組中的蛋白質水解成分子量相對較小的多肽。
隨后利用離子交換色譜法通過逐步增加鹽濃度將這些肽分離。
每一步，略提高鹽濃度，將結合能力較弱的肽洗脫至反相磁珠。流動相為乙腈梯度洗脫液，借助疏水性洗脫多肽。
MudPIT 法中，依次將離子交換磁珠和反相磁珠裝入毛細管柱，從反相部分流出的洗脫液直接進入電噴霧質譜儀（圖49）。
這一過程重復多次，能夠實現蛋白質組水解產物肽的重要分離（圖50）。

二維色譜法分離蛋白酶水解產物多肽的優點是將蛋白質分解成肽,允許凝膠電泳法無法實現的蛋白質分離和鑒定，例如一些疏水性膜結合蛋白和低豐度蛋白。
缺點是有關PTM的信息通常在MudPIT法中丟失。
此外，形成肽的數量要遠遠多于蛋白質，平均每個蛋白質水解得到20~50個肽，且必須分離。

圖49. 多維蛋白質鑒定技術（MudPIT）包括通過離子交換色譜法實現的整個蛋白質組蛋白酶水解產物的初步分離以及對離子交換分離出片段中多肽的反相分離。
將離子交換磁珠和反相磁珠裝入毛細管柱，從反相部分流出的洗脫液直接進入電噴霧質譜儀。