干旱脅迫對于植物來說，是一個全球普遍存在的問題。會限制植物的生長發育。西北是我國蘋果的最大產區，長期的中度干旱是限制蘋果產業發展的一個重要因素，然而目前果樹方面關于中度干旱脅迫響應的分子機制研究較少。

樣本來源

蘋果砧木葉片組織，4組樣本分別來源于干旱敏感型材料M26（干旱處理、對照）、干旱耐受型材料MBB（干旱處理、對照）。

技術路線

iTRAQ，三個生物學重復

研究結果

1. 中度干旱脅迫響應的生理變化

研究團隊測定了4組樣本的相對含水量（RWC）、葉面積（LA）、比葉重(LMA)、游離脯氨酸含量(CFP)、可溶性糖含量(CSS)、丙二醛含量 (MDA)。生理實驗結果顯示，RWC, CFP, CSS以及MDA的變化可能會影響蘋果砧木對于中度干旱耐受程度。與M26相比，MBB在中度干旱脅迫下能夠產生更多的滲透調節物質。

2. 磷酸化修飾位點以及磷酸化蛋白鑒定
本次共鑒定到595個磷酸化肽段，682個磷酸化修飾位點以及446個磷酸化蛋白。這682個磷酸化修飾位點分別位于絲氨酸（86.95%）、蘇氨酸（11.73%）以及酪氨酸（1.32%）。

磷酸化修飾位點分布

3. 差異磷酸化蛋白鑒定及生物信息學分析
通過分別與對照比較，中度干旱脅迫下的M26和MBB中，磷酸化水平顯著變化的蛋白分別為5個和35個。其中4個在兩個材料中都有，這有可能是兩個基因型在響應干旱脅迫的機制方面有一些相似之處。在本次鑒定446個的蛋白中，有26個為蛋白激酶，其中10個為常見的干旱脅迫響應激酶，但在本次研究中，這些激酶幾乎都沒有表現出顯著的表達差異。

在獲得差異磷酸化修飾肽段及蛋白信息后，研究團隊進行了GO分析。結果表明這些差異磷酸化蛋白與代謝、轉錄、翻譯和蛋白加工等有關。

差異蛋白質的Venn圖

差異磷酸化蛋白質的GO功能分析

隨后，研究團隊利用motif-X對于差異蛋白的磷酸化修飾進行特征分析，結果表明，在差異磷酸化蛋白中，磷酸化修飾均位于絲氨酸，且[PxsP], [sP], [sD], [Rxxs], [sxP] 和 [sxs]等6種修飾特征最為普遍。

差異磷酸化蛋白質的修飾特征分析

4.  qRT-PCR 驗證
研究團隊選擇了17個基因進行qRT-PCR 驗證。結果表明，M26中ACBP4基因表達水平下降，此時蛋白磷酸化修飾水平上升。在MBB中，RPL5, eIF3B, Hsp70, Hsp70-90, DEK 以及 TUBA3在表達水平顯著增加，與磷酸化水平變化趨勢一致。這些結果表明，在中度干旱脅迫下，蘋果砧木的mRNA與蛋白磷酸化修飾的變化有一定的相關性。

qRT-PCR 驗證

小編心得

本文利用蛋白質組學技術（iTRAQ）對比了干旱敏感基因型材料M26以及干旱耐受型MBB在中度干旱脅迫條件下的生理學和磷酸化蛋白組方面的變化。通過目前常見的生信分析（GO、Motif-X）以及驗證手段（qPCR）獲取可信度較高的目標性磷酸化修飾蛋白質，為進一步的安濤蘋果中度干旱耐受的分子機制，提供更為準確的研究范圍。