非特異性條帶？
沒有什么比以多個(gè)條帶結(jié)束你的western blot實(shí)驗(yàn)更令人沮喪。 這是我的樣品嗎？ 封閉液的問題？ 抗體的問題？ 如果您正在使用新的樣本或抗體，答案可能是，也不確定。 通過一次更改一個(gè)變量，對(duì)Western進(jìn)行故障排除是一個(gè)痛苦的過程。 我們不能完全地讓你所有的問題都消失，但這里有一些提示可以幫助你提高你的印跡質(zhì)量。
樣品的問題？
樣品質(zhì)量差是多個(gè)條帶的主要來源。 以下是蛋白樣本可能出現(xiàn)的一些常見問題。

• 如果您觀察到多個(gè)條帶在預(yù)期分子量下，您的蛋白質(zhì)很可能已經(jīng)降解。 確保在蛋白質(zhì)提取過程中添加蛋白酶抑制劑并保持樣品低溫狀態(tài)。
• 如果條帶大于預(yù)期分子量，請(qǐng)檢查文獻(xiàn)中的磷酸化，糖基化，乙酰化或甲基化等修飾，將蛋白放在更大尺寸的膠中進(jìn)行跑膠。
• 如果到處都有條帶，您可能加載了過多的樣品，這些樣品會(huì)導(dǎo)致對(duì)無(wú)關(guān)的裂解蛋白非特異性吸附。 在樣品制備方面，不要忘記在上樣前加熱到至少60°C使樣品變性。
• 您的目的蛋白可能與其他蛋白共享表位。 要進(jìn)行檢查，請(qǐng)運(yùn)行BLAST搜索以查看目的蛋白的唯一性。
• 另一種可能性是，細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)表達(dá)隨著時(shí)間的推移而逐漸消失。 如果可以的話，重新開始使用新的非傳代細(xì)胞。

封閉液的問題？
使用錯(cuò)誤的封閉緩沖液會(huì)給你的印跡帶來災(zāi)難。 許多常用的封閉緩沖液可以掩蓋目標(biāo)上的表位，使其難以檢測(cè)。 或者是封閉無(wú)效產(chǎn)生非特異性結(jié)合。


一抗和二抗的問題？
一抗和二抗也會(huì)產(chǎn)生麻煩。 在選擇一抗時(shí)，通常有很多選擇。 為獲得最佳結(jié)果，請(qǐng)選擇經(jīng)過親和純化并根據(jù)您的應(yīng)用進(jìn)行驗(yàn)證的抗體。 親和純化從制劑中消除了大量非特異性免疫球蛋白，產(chǎn)生更干凈的印跡。 驗(yàn)證您所選擇的抗體是否已被您的同伴成功使用可查詢抗體搜索引擎，例如CiteAb：https：//www.citeab.com/