植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒

●     產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

植物原生質(zhì)體是指脫去全部細(xì)胞壁由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細(xì)胞。它具有細(xì)胞生命特征和全能型，是細(xì)胞無(wú)性系變異和突變體篩選的重要來(lái)源，同時(shí)也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質(zhì)體是一個(gè)常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，去除細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。許多方法可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進(jìn)行清洗，使原生質(zhì)體融合得以完成。

本試劑盒含有除酶以外植物原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化需要的全部試劑，按照一次使用10ml酶液計(jì)算，可以使用20次。

● 貯存和效期： 按照溫度貯存，有效期一年。

● 使用說(shuō)明：

   需要準(zhǔn)備的材料（試劑盒不提供）：

纖維素酶R-10；離析酶R-10；平頭鑷子；70μm細(xì)胞過(guò)濾篩；一次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水浴鍋

一、原生質(zhì)體分離：

即用型酶溶液配制

2. 酶解后加入10 ml溶液II，輕柔混勻。

3. 用孔徑70 μm篩網(wǎng)過(guò)濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50ml離心管中。

4. 濾出液100g常溫離心 2分鐘，去除上清。

5. 加1 ml 溶液II重懸原生質(zhì)體，冰浴30分鐘（原生質(zhì)體會(huì)自然沉淀于底部）。

6. 小心去除上清溶液，不要觸動(dòng)原生質(zhì)體沉淀，沉淀重懸于1 ml溶液III中即為原生質(zhì)體溶液。

二、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：

1. 取10μl質(zhì)粒DNA(濃度為1 -2μg/μl)于1.5ml 離心管中。

2. 加入100μl原生質(zhì)體溶液，輕柔混勻。

3. 加入等體積即110μl 溶液IV-轉(zhuǎn)化溶液，輕柔徹底混勻，常溫放置15分鐘，間歇輕柔混勻。

4. 加入2倍體積即440μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉(zhuǎn)化過(guò)程。

5. 常溫100g離心2分鐘，去上清。

6. 沉淀重懸于1 ml溶液V中。

三、原生質(zhì)體培養(yǎng)和收集：

1. 原生質(zhì)體溶液 常溫（20-25℃）孵育2-16小時(shí)。

 注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定孵育時(shí)間。RNA分析孵育2-6小時(shí)；酶活性分析和蛋白標(biāo)記實(shí)驗(yàn)孵育2-16小時(shí)。

2. 常溫100g離心2分鐘收集原生質(zhì)體，去除大部分上清。

3. 原生質(zhì)體沉淀重懸于剩余溶液中，-80℃貯存。