DNA甲基轉移酶3A活性酶連續循環比色法定量檢測試劑盒產品說明書

（中文版）

主要用途

DNA甲基轉移酶3A（DNMT3A）活性酶連續循環比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成人工合成甲基受體底物分子和抑制復合物，通過DNA甲基轉移酶、腺苷同型半胱氨酸核苷酶、腺嘌呤脫氨酶和黃嘌呤氧化酶反應系統中生成過氧化氫，使用顯色染料和過氧化酶后，產生醌亞胺產物吸光峰值的變化，即采用比色法來測定細胞或組織裂解樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞或組織裂解懸液樣品（動物、人體等）DNA甲基轉移酶3A的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

技術背景

生物分子的甲基化在各種生物體系統里，諸如信號傳導、生物合成、蛋白修復、基因沉默和染色質調節等，發揮著重要作用。將甲基基團加入到CpG二核苷酸上的5’位的胞嘧啶（cytosine）上，成為5’甲基胞嘧啶（5’-methylcytosine），是哺乳動物細胞的一種重要的表觀遺傳修飾，與胚胎發育、腫瘤發生和遺傳疾病有關。DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase；DNMT）催化這一甲基修飾的維持和發生。DNA甲基轉移酶分為三種：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1作用于維持甲基化狀態，而DNMT3在于建立新的甲基化（de novo methylation）。基于普魯卡因胺（procainamide），一種非核苷酸類抑制劑，特異性抑制DNA甲基轉移酶1活性，以及曲古霉素A（trichostatin A；TSA），一種抗真菌類抗生素，特異性抑制DNA甲基轉移酶3B活性的特征，參與其反應體系，即S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine；SAM），又稱為AdoMet，作為最常用的甲基直接供給體，通過DNA甲基轉移酶把甲基基團轉移到人工合成甲基受體底物分子poly[d（I-C） d（I-C）]上，而生成S腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine；AdoHcy），進而快速被腺苷同型半胱氨酸核苷酶（AdoHcy nucleosidase）分解為S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine）和腺嘌呤（adenine），避免了前者累積后負反饋抑制甲基化過程。腺嘌呤由腺嘌呤脫氨酶（Adenine deaminase）產生次黃嘌呤，通過黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）催化，生成過氧化氫，然后借助過氧化酶（peroxidase）的作用，與對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反應，形成有色醌亞胺（quinoneimine），通過其吸收峰值的變化（510nm波長），來定量分析DNA甲基轉移酶3A的活性。DNA甲基轉移酶3A反應系統為：

DNA methyltransferase 3A

poly[d（I-C） d（I-C）] + AdoMet  →  methyl poly[d（I-C） d（I-C）]  + S-adenosylhomocysteine

                                AdoHcy nucleosidase

S-adenosylhomocysteine    →   adenine  +  S-ribosylhomocysteine

Adenine deaminase

adenine  → hypoxanthine

xanthine oxidase

hypoxanthine  +  2H2O  +  O2  →   urate  +  2H2O2 

                            peroxidase

 2H2O2  +  p-hydroxybenzoic acid  +  4-aminoantipyrine  →   quinoneimine  +  4H2O

產品內容

緩沖液（Reagent A）   3毫升

底物液（Reagent B）      250微升

反應液（Reagent C）      250微升

陰性液（Reagent D）   250微升

專性液（Reagent E） 250微升

產品說明書      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；底物液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長510nm，間隔5分鐘，讀數3次（共15分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent B）避免光照；緩沖液（Reagent A）置于室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取90微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升專性液（Reagent E）
• 加入10微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升反應液（Reagent C）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升陰性液（Reagent D） 
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（15分鐘讀數－0分鐘讀數）

• 樣品活性測定

• 移取90微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入10微升專性液（Reagent E）
• 加入10微升底物液（Reagent B）
• 加入10微升反應液（Reagent C）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測樣品（20微克核蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（15分鐘讀數－0分鐘讀數） 

四、計算樣品活性 

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.125（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.58（毫摩爾吸光系數）X 15（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾S-腺苷甲硫氨酸 /分鐘

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取90微升緩沖液（Reagent A）到96孔板里
• 分別加入10微升專性液（Reagent E） 
• 分別加入10微升底物液（Reagent B）
• 分別加入10微升反應液（Reagent C）
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent D）或待測樣品（20微克核蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和15分鐘讀數
• 活性計算：

[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.125（毫升，測定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 6.58（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 15（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾S-腺苷甲硫氨酸/分鐘

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用純化細胞核裂解懸液（20微克核蛋白）作為待測樣品
• 樣品中避免使用DTT、巰基乙醇、TCEP、EDTA等
• 樣品須澄清，至關重要
• 加樣后3秒內比色測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續15分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定15分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為20微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• DNA甲基轉移酶3A單位活性定義為：在37℃，pH 8.0條件下，每分鐘內能夠轉移1微摩爾S-腺苷甲硫氨酸甲基所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列甲基化檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感