植物生長離不開各種的金屬與非金屬元素。這些元素通過土壤、大氣、水進入植物體內，通過植物體內的運輸和一系列生理生化反應分布到植物的各個部位。各種元素對植物的影響一直是植物研究的重要熱點之一。這項研究的焦點主要集中在兩個方面：1. 由于日趨嚴重的糧食安全問題，如何獲得最優化的施肥方法既可以提高作物產量和質量，又能減少對環境造成的可能傷害（富營養化等）是擺在全人類面前的重大課題；2. 現代工業造成環境中嚴重的重金屬污染，這些重金屬通過植物富集并傳導到動物圈和人類。為了搞清楚這兩個問題的運行規律并找到解決方案，就必須對植物在不同元素條件的生理生態反應進行研究。

    
    圖1. 礦物質和水分在植物體內的運輸過程（https://online.science.psu.edu/）

很多傳統的植物生理生化指標和元素分析方法大都需要將樣品取回實驗室，并進行破壞性預處理。這一過程中很多重要的信息都可能缺失或者產生變化，而且不能做到對同一個樣品進行長期監測，難以估量植物不同生長期的差異變化。本文將介紹一些國際上最先進的用于植物原位養分利用與重金屬毒害研究的無損/準無損儀器技術。

一、葉綠素熒光/葉綠素熒光成像分析技術

葉綠素熒光動態分析技術是目前最快捷無損的監測植物生物與非生物脅迫下光合性能的技術，也是用于植物生理學和生態生理學研究的最有效的、最權威的和應用最廣的技術之一（Lu，2001；Lu，1999）。因此在葉綠素熒光技術剛剛發展成熟之初，這項技術就被用于植物養分和金屬脅迫研究。1985年Sivak發現N、P、K、Mn、Fe、S或Cu缺乏的甜菜，葉綠素熒光曲線與對照組產生了偏離（Sivak, 1985）。Abadia在1988年就提出了用葉綠素熒光測量的方法來快速簡便地檢測植物營養缺失（Abadia，1988）。

 圖2. 大麥Mn缺乏與Mn充足造成OJIP快速瞬變熒光動力學曲線變化（Hebbern, 2005）

但是傳統的葉綠素熒光技術也有其局限性。一般的葉綠素熒光儀僅能通過光纖測量一個點的總值。無法展示樣品不同部位、結構的差異，更難以研究脅迫受損組織的分布以及受損部分和健康部分的差異，測量的數據無法代表測量樣品的全部情況。隨著Charge-CoupledDevice(CCD)相機技術、電腦圖像分析技術以及LED光源板技術的成熟，從上世紀八十年代末開始，葉綠素熒光成像技術開始逐漸發展起來。Ladislav Nedbal等于上世紀90年代末期發明了與PAM技術相結合的葉綠素熒光成像技術，研制成功了第一臺FluorCam調制式葉綠素熒光成像儀（Nedbal，2000），使得葉綠素熒光研究正式進入二維時代。這一技術發明以后，就因為其可以直觀定量反映營養元素與重金屬對植物光合系統產生影響的部位、分布、面積及具體機理，而迅速取代傳統的葉綠素熒光儀。

  
    圖3. 最初的FluorCam調制式葉綠素熒光成像儀設計圖與熒光成像圖（Nedbal，2000）

山東農業大學使用FluorCam研究了兩種玉米在不同施氮條件下光合特性的變化（Li, 2012）。研究發現，施加氮肥使兩個品種的最大光化學效率Fv/Fm和量子產額ΦPSII都有所升高，而ΦPSII的升高幅度要高于Fv/Fm，表明氮肥對PSII的實際功能活性更有作用。同時玉米品種HZ4熒光參數的升高幅度也要高于Q319，這應該是由于HZ4是一種低N效率的非持綠玉米。

Vaculík研究了硅元素對緩解玉米鎘毒害的作用。通過檢測玉米葉片的實際量子產額ΦPSII發現：在低濃度鎘處理下，添加硅元素幾乎可以消除鎘的毒害；在高濃度處理下，添加硅元素不但減輕了鎘毒害的程度，同時也使毒害面積大為減少（Vaculík，2015）。

FluorCam葉綠素熒光成像系統也用于大氣重金屬等污染監測研究。Hida通過對監測鋼鐵廠不同距離白楊葉片的相對熒光衰減指數Rfd，發現了空氣污染影響植物光合系統的規律與季節波動，也為監測空氣污染找到了靈敏直觀的生物指標（Hida, 2014）。

              圖7. FluorCam系列葉綠素熒光成像系統

二、多光譜熒光動態顯微成像技術（Fluorescence Kinetic Microscope）
FluorCam葉綠素熒光成像技術的出現解決了研究各種脅迫因素對植物宏觀光合表型的問題。但對于微觀層次，每個細胞乃至葉綠體的光合表型研究還是無能為力。就在Nedbal開發FluorCam葉綠素熒光成像技術的同時，他就與德國康斯坦丁大學教授Küpper、捷克科學院Martin Trtilek（Photon Systems Instruments公司總裁，Nedbal為Photon Systems Instruments公司首席科學家）共同開發了而用于微觀熒光成像的Fluorescence kinetic microscopy（FKM）熒光動力學顯微成像技術（Küpper，2000）。從此葉綠素熒光動力學研究才能夠研究各種不同尺度的樣品，比如葉綠體、細胞、植物組織、器官乃至整個植物個體。之后，FKM技術被廣泛用于藻類的葉綠素熒光研究。

2007 年，Küpper 繼續與 Martin Trtilek和 PSI 公司合作開發了新版本的FKM多光譜熒光動態顯微成像系統（Küpper，2007）。新型的FKM增加了如下幾種主要功能：1.能夠對熒光成像圖中選定部位進行葉綠素熒光動力學分析，這樣就能直接對比分析植物健康部位和受損部位的差別；2.具備多種不同光質（紅光、藍光、白光、綠光、UV紫外光、遠紅光等）的激發光源，可以研究各種不同天線色素的葉綠素熒光動力學和其他非葉綠素熒光動力學；3.配備光譜儀，可以直接研究激發的各種熒光的光譜變化。同時，Küpper將FKM和FluorCam結合使用，將FKM的應用從單純的藻類擴展到對高等植物葉綠體的活體原位研究，尤其是重金屬對植物微觀光合結構的毒害效應。

       
圖8. 上圖：FKM初期設計及其藻類葉綠素熒光成像圖；
下圖：FKM最新設計及其鎘脅迫處理天藍遏藍菜Thlaspi caerulescens顯微結構葉綠素熒光成像圖

正是由于FKM技術提供了這樣強大的研究工具，之后很多科學家相繼使用FKM技術研究了海州香薷Elsholtzia splendens、沼澤景天Crassula helmsii、Haumaniastrum katangense、天藍遏藍菜Thlaspi caerulescens等植物和束毛藻Trichodesmium、金魚藻Ceratophyllum demersum、米氏凱倫藻Karenia mikimotoi等藻類的Fe、Cu、Ni、Zn、Cd微觀毒害與調控機制，以及藻類的固氮作用與由于富營養化造成水華的發生機理（Higo, 2017；Andresen，2016； Peng，2013；Peng，2012；Leitenmaier，2011；Küpper，2009）。

  
圖9. 束毛藻Trichodesmium的熒光動態顯微（FKM）成像圖（Küpper，2008）

三、多光譜/高光譜成像技術
植物由于在可見光-近紅外波段具備獨特的反射光譜特征曲線。因此通過特定波段反射率計算的各種植被指數就可以反應植物相應的生理特征。

   
              圖10. 植物的反射光譜及不同波段的意義

常用的植被指數有歸一化植被指數NDVI、光化學植被反射指數PRI、歸一化葉綠素指數NPCI、簡單比值指數SR、改進的葉綠素吸收反射指數MCARI、最優化土壤調整植被指數OSAVI、綠度指數G、轉換類胡羅卜素指數TCARI、三角植被指數TVI等。而這其中最為常用的就是歸一化植被指數NDVI，其計算公式為：

這一指數反映了植物葉綠素在紅光波段的高吸收和近紅外波段的高反射，與植物的葉綠素濃度密切相關，進而可以反推出植物氮含量（Maarschalkerweerd，2015）。

FluorCam葉綠素熒光系統本身即具備NDVI成像測量功能，可以完成葉綠素熒光與NDVI成像的同步測量。

 
   圖11. 使用FluorCam成像系統測量的珊瑚與藻類共生體的NDVI成像（Leal，2015）

而為了滿足現代植物表型組學研究的需要，PSI公司在FluorCam葉綠素熒光成像技術的基礎上，整合了LED植物智能培養、自動化控制系統、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、自動條碼識別管理、RGB真彩3D成像、自動稱重與澆灌系統等多項先進技術建立了PlantScreen植物表型成像系統，以最優化的方式實現大量植物樣品——從擬南芥、玉米到各種其它植物的全方位生理生態與形態結構成像分析，是目前植物表型組學包括養分元素與重金屬脅迫研究最全面的儀器系統。

       
       圖12. PlantScreen植物表型成像分析系統及其各個功能模塊

如果需要在更大尺度上進行多光譜/高光譜成像分析，目前最為適合的就是無人機遙感技術。無人機遙感技術是無人機技術與遙感成像分析技術等高新技術的創新性集成系統平臺，使植物表型分析真正從實驗室走向大田野外、從單個葉片或單株植物或幾十平方米的視野一下子躍升到幾百畝或者上千畝甚至更大范圍、從每天幾千株植物的高通量躍升到幾百萬幾千萬甚至更多的超高通量測量分析。

International Maize and Wheat Improvement Center利用無人機表型分析技術，對大田玉米貧氮脅迫抗性進行了研究分析，研究結果參見下列圖表： 

   
圖13. 不同梯度氮脅迫（左圖中ss指高度氮脅迫、ms為中度氮脅迫、c為正常施肥）及根據NDVI得出的氮脅迫指數。

UAS-4四旋翼專業表型分析無人機平臺或UAS-8八旋翼專業表型分析無人機平臺配置高清晰RGB鏡頭、多光譜鏡頭、高光譜鏡頭、紅外熱成像鏡頭及LiDAR等傳感器，及相應數據處理分析軟件組成。多年與PSI植物表型分析研究中心合作，積多年植物／作物表型分析技術服務經驗，為植物表型分析提供全面技術方案；PhenoUAS可測量分析植物的形態結構性狀如葉面積、覆蓋度、株高、冠幅等等，還可測量分析植物的功能性狀如長勢、抗性、脅迫（包括生物脅迫與非生物脅迫）、產量評估等。

圖14. 左：PhenoUAS-8八旋翼無人機植物表型分析平臺在陜西楊凌飛行作業示范；右上：西北農林科技大學小麥田NDVI遙測成像圖；右下：陜西佛坪大熊貓保護區植被分類遙測圖，粉色-松樹，綠色-竹子，黃色-裸地道路，藍色-雪

四、激光誘導擊穿光譜分析技術Laser-Induced BreakdownSpectroscopy（LIBS）
葉綠素熒光成像技術、多光譜/高光譜成像分析技術雖然可以最優化地測量植物對元素和重金屬的生理生態反應，但畢竟不能直接測量元素和重金屬在植物體的具體含量和分布情況。

但是，傳統的植物元素測量方法比如比色法colorimetry、光譜測定法spectrometry、高溫堿溶high temperature alkaline dissolution和電熱氣化electro-thermal vaporization 配合上電感耦合等離子體原子發射光譜inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy (ICP-AES)、離子淌度譜法ion mobility spectrometry (IMS) 和石墨爐原子吸收光譜法graphite furnace atomic absorption spectrometry (GFAAS)等。

這些技術用于植物元素分析還是有很多問題。比如樣品需要消解、樣品的預處理需要消耗昂貴的化學藥品并耗費大量時間、由此還會導致環境的潛在破壞（Tripathi，2015）。而這些技術更大的局限性是難以表現植物元素的差異性分布，同時又因為必須對樣品進行破壞性預處理而不能做到無損/準無損原位測量和長期監測。

激光誘導擊穿光譜分析技術Laser-Induced Breakdown Spectroscopy（LIBS）的逐漸成熟解決了這一問題。該技術通過超短脈沖激光聚焦樣品表面形成等離子體，利用光譜儀對等離子體發射光譜進行分析，以此來識別樣品中的元素組成成分。該技術的特點有：
1.快速直接分析，幾乎不需要樣品制備
2.可進行準無損測量
3. 可進行元素分布二維制圖
4.可進行遠距離遙測
5.可檢測幾乎所有元素
6.可同時分析多種元素
7.基體形態多樣性 - 可以檢測幾乎所有固態樣品，乃至液體、氣體樣品
8.精度最高可達到ppm級

  
    圖15. 左：Sci-Trace LIBS元素分析系統；右：X-Trace LIBS元素遙測分析系統

這一技術最初主要用于材料、冶金、地質、礦物等研究。CEITEC歐洲工程技術中心AtomTrace LIBS研究團隊可以說是最早關注到LIBS技術在生命科學和生物醫學領域應用的科研團隊之一。2005年，Jozef Kaiser博士（Atomtrace科學主任、布爾諾大學教授、激光光譜學研究室負責人、CEITEC物質特性與表面科學研究部主任）等在European Physical Journal上發表了“Mapping of the metal intake in plants by large-field X-ray microradiography and preliminary feasibility studies in microtomography”(Eur.Phys.J. D 32, 113-118)；2006年又利用LIBS飛秒激光光譜分析技術研究分析了植物樣品鐵、錳元素的分布并首次作出完整葉片鐵元素的二維分布圖，并發表了“Femtosecond laser spectrochemical analysis of plant samples”（Laser Phys.Lett.3, No.1, 21-25, 2006）。

2007年至2010年，以Kaiser博士為代表的研究團隊利用μCT與飛秒激光誘導擊穿光譜技術（LIBS）及LA-LCP-MS等技術，對向日葵等植物組織中重金屬元素吸收積累進行了研究分析，先后發表論文：
1)Monitoring of the heavy-metal hyperaccumulation in vegetal tissues by X-ray radiography and by Femto-second laser induced breakdown spectroscopy. Microscopy research and technique 70:147-153, 2007；
2)Utilization of laser induced breakdown spectroscopy for investigation of the metal accumulation in vegetal tissues. SpectrochimicaActa Part B 62:1597-1605；
3)Investigation of heavy-metal accumulation in selected plant samples using laser induced breakdown spectroscopy and laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. Appl. Phys. A 93:917-922, 2008；
4)Multi-instrumental analysis of tissues of Sunflower plants treated with Silver(I) ions—plants as bioindicators of environmental pollution
5)Mapping of lead, magnesium and copper accumulation in plant tissues by laser-induced breakdown spectroscopy and laser-ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. SpectrochimicaActa Part B 64:67-73, 2009;
6)Sunflower plants as bioindicators of environmental pollution with lead(II) ions. Sensors 9:5040-5058, 2009；
7)Detection of lead in Zea mays by dual-energy X-ray Microtomography at the SYRMEP Beamline of the ELETTRA Synchrotron and by Atomic Absorption Spectroscopy. Microscopy Research and Technique 73:638-649, 2010;
8)Determination of plant thiols by liquid Chromatography Coupled with Coulometric and Amperometric Detection in Lettuce treated by lead(II) ions. Electroanalysis 22 No.11:1248-1259, 2010

在這些研究中，CEITEC/Atomtrace LIBS研究團隊不僅最早利用LIBS技術作出完整葉片元素分布圖，還最早利用LIBS技術與顯微CT（μCT）相結合進行三維化學成像構建，同時還開展了小鼠腎臟、蛇骨、古生物牙齒等動物樣品的LIBS元素分析研究。

2012年，Kaiser博士等根據多年的研究成果和同行研究情況，撰寫發表了綜述性文章“Trace elemental analysis by Laser-induced breakdown spectroscopy---biological applications”(Surface Science Report 67:233-243, 2012)。上述研究成果奠定了以Kaiser博士等為代表的激光光譜學實驗室LIBS技術在全球生命與環境科學應用領域的領先地位。

在研究植物養分利用與重金屬毒害時，LIBS技術經常會與葉綠素熒光技術聯合應用。2012年，CEITEC激光光譜學實驗室研究團隊與PSI公司合作，在《SpectrochimicaActa Part B》發表了“Application of laser-induced breakdown spectroscopy to the analysis of algal biomass for induxrial biotechnology”,該研究利用LIBS技術和特制液體樣品激光作用室，分析了藻類培養液與生物膜中鉀、鎂、鈣、鈉等與藻類至關重要的元素及銅等毒性重金屬元素積累。

印度阿拉哈巴德大學則通過FP100葉綠素熒光儀（FluorCam的非成像版）和LIBS技術結合，研究了小麥經過重金屬處理，植物體內元素含量變化與葉綠素熒光光合特性的關系。研究成果連續發表了多篇文獻（Tripathi，2016；Tripathi，2015）

  
      圖18. 左：LIBS藻類測量方案；右：藻類生物膜脈沖激光剝蝕孔

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易科泰生態技術致力于引進、消化、吸收和創新國際先進生物生態科研技術，提供植物表型分析、作物脅迫敏感性與抗性檢測、光養生物反應器／藻類培養與在線監測、生態毒理學檢測技術方案和實驗服務與合作。旗下的Ecolab實驗室目前配備有FluorCam封閉式熒光成像系統、FluorCam封閉式熒光成像系統、FluorCam便攜式熒光成像儀、FL3500葉綠素熒光儀、FluorPen手持式葉綠素熒光儀、AquaPen藻類熒光儀、PolyPen手持式植物光譜測量儀、SpectraPen LM500手持式光譜儀、PlantPen手持式光譜儀、FMT150藻類培養與在線監測系統、MC1000 8通道藻類培養與在線監測系統、MicroMac1000全自動營養鹽分析監測系統、FMS CO2/O2呼吸測量分析系統等，并與中科院植物所、中科院水生所、中國農科院、陜西師范大學等建立了長期技術合作交流關系。歡迎聯系開展實驗合作與技術培訓。郵箱：eco-lab@eco-tech.com.cn，info@eco-lab.cn; 電話：010-62615899

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