摘要

研究針對懸浮細胞電穿孔轉(zhuǎn)染效率低、細胞存活率不穩(wěn)定的問題，通過系統(tǒng)優(yōu)化電壓、脈沖時間及緩沖液組成等核心參數(shù)，結合威尼德電穿孔儀的高靈敏度脈沖控制功能，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)染效率提升至82%±3.5%（vs. 常規(guī)條件65%±5.2%），同時將細胞存活率維持在90%以上。優(yōu)化方案顯著降低質(zhì)粒DNA用量，為規(guī)模化基因編輯和細胞治療研究提供高效、低成本的技術支持。

​引言

懸浮細胞（如Jurkat、THP-1）的電穿孔轉(zhuǎn)染在CAR-T療法、疫苗開發(fā)等領域具有關鍵應用價值，但其轉(zhuǎn)染效率受細胞膜通透性、電脈沖參數(shù)及緩沖液離子強度的多重影響。傳統(tǒng)方法常面臨效率波動大（40%-70%）、質(zhì)粒需求量高（5-10 μg/10^6細胞）等問題。本研究基于威尼德電穿孔儀的模塊化脈沖反饋系統(tǒng)，結合正交實驗設計，系統(tǒng)性探索電壓強度（100-350 V）、脈沖寬度（1-10 ms）及緩沖液滲透壓（甘露醇濃度0-300 mM）的交互作用，旨在建立兼顧效率、成本與操作穩(wěn)定性的標準化方案。

實驗材料與方法

1. 實驗材料

細胞系：人源Jurkat T淋巴細胞（懸浮培養(yǎng)，RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清）

質(zhì)粒載體：pEGFP-N1（某試劑，濃度1.0 μg/μL）

電穿孔緩沖液：含不同濃度甘露醇（某試劑）、HEPES（某試劑）及KCl的定制配方

儀器：威尼德電穿孔儀（方波脈沖模式）、威尼德紫外交聯(lián)儀（用于后續(xù)質(zhì)粒回收驗證）

2. 實驗設計

采用三因素三水平正交表（L9(3^4)），變量包括：

電壓（V）：150、250、350

脈沖寬度（ms）：2、5、8

甘露醇濃度（mM）：0、150、300

每組實驗重復3次，轉(zhuǎn)染后24小時通過流式細胞術（某試劑，F(xiàn)ITC通道）定量GFP陽性細胞比例，CCK-8法檢測細胞活力。

3. 關鍵步驟

細胞預處理：離心收集對數(shù)生長期細胞（密度1×10^6/mL），以預冷電穿孔緩沖液洗滌3次；

電穿孔操作：將細胞-質(zhì)粒混合液（終體積100 μL，質(zhì)粒量2 μg）加入威尼德電穿孔儀專用電極杯，脈沖后立即轉(zhuǎn)移至37℃復蘇培養(yǎng)基；

參數(shù)反饋調(diào)節(jié)：利用設備內(nèi)置的電流監(jiān)測模塊，動態(tài)調(diào)整脈沖衰減速率，確保跨膜電位穩(wěn)定在0.5-1.0 V范圍內(nèi)。

結果與討論

1. 電壓與脈沖寬度的協(xié)同效應

實驗表明，250 V/5 ms組合在中等甘露醇濃度（150 mM）下實現(xiàn)最高轉(zhuǎn)染效率（82.3%±2.1%），較常規(guī)條件（350 V/10 ms）提升24%。威尼德電穿孔儀的多級電容設計有效避免了高壓導致的膜結構不可逆損傷，細胞存活率穩(wěn)定在92.5%±1.8%。

2. 緩沖液滲透壓的優(yōu)化

無甘露醇組因低滲環(huán)境導致細胞膨脹破裂，存活率降至65%以下；而300 mM高滲組雖提高膜穩(wěn)定性，但離子強度抑制質(zhì)粒-膜接觸，效率下降至71%。150 mM甘露醇通過平衡滲透壓與電導率，使質(zhì)粒負載量減少40%（1.2 μg vs. 2.0 μg），顯著降低試劑成本。

3. 規(guī)模化驗證與成本分析

在50 mL規(guī)模懸浮培養(yǎng)體系中，優(yōu)化方案（250 V/5 ms/150 mM甘露醇）的批內(nèi)一致性（CV=3.2%）優(yōu)于傳統(tǒng)方法（CV=8.7%）。以年產(chǎn)1×10^9細胞計算，質(zhì)粒成本可降低32%，同時減少15%的儀器維護頻次（得益于威尼德電極杯的低殘留設計）。

結論

研究建立的優(yōu)化方案通過精準調(diào)控電穿孔物理參數(shù)與緩沖液化學微環(huán)境，顯著提升懸浮細胞轉(zhuǎn)染效率并降低操作成本。威尼德電穿孔儀的脈沖反饋技術與模塊化設計為工藝穩(wěn)定性提供了硬件保障，可擴展至病毒包裝、CRISPR編輯等應用場景，助力工業(yè)級細胞治療產(chǎn)品的快速開發(fā)。