m5C MeRIP-seq等揭示m5C修飾在癌癥耐藥中的關(guān)鍵調(diào)控機制中的應(yīng)用
甲狀腺未分化癌（Anaplastic Thyroid Cancer, ATC）是一種極具侵襲性的甲狀腺癌，通常在初診時就已出現(xiàn)局部晚期浸潤或遠處轉(zhuǎn)移，錯過了最佳手術(shù)時機。因此，系統(tǒng)化療和靶向治療對于改善ATC患者的預(yù)后至關(guān)重要。然而，ATC對傳統(tǒng)治療表現(xiàn)出顯著的耐藥性，這使得研究其耐藥機制并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，RNA修飾（尤其是m5C修飾）在腫瘤發(fā)生和耐藥性中的作用逐漸受到關(guān)注，但其在ATC中的具體機制尚不清楚。
近日，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院鄭向前教授團隊以甲狀腺未分化癌（ATC）為研究對象，利用m5C MeRIP-seq等技術(shù)揭示了NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在ATC耐藥性中的作用機制，闡明了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC多藥耐藥性（Multidrug Resistance, MDR）中的關(guān)鍵作用，并提出通過小分子NSUN2抑制劑克服耐藥性的新策略。這一發(fā)現(xiàn)不僅為ATC的治療提供了新的靶點，也為理解RNA修飾在腫瘤耐藥性中的作用提供了重要依據(jù)。相關(guān)研究成果以《NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis》為題發(fā)表于《Theranostics》雜志。
標(biāo)題：NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis（NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸驅(qū)動可變剪切重編程并促進甲狀腺未分化癌的多藥耐藥性）
發(fā)表時間：2025-1-27
發(fā)表期刊：Theranostics
影響因子：IF 12.4/Q1
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、scRNA-seq、bulk RNA-seq（易基因金牌技術(shù)）
本研究通過對ATC樣本的bulk轉(zhuǎn)錄組（bulk RNA-seq）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)進行全面分析，以篩選與多藥耐藥性（MDR）相關(guān)的m5C修飾基因。隨后進行IC50實驗、流式細胞術(shù)分析，并利用Nsun2基因敲除的自發(fā)性甲狀腺癌（spontaneous tumorigenic ATC）小鼠模型，證明了NSUN2在ATC中促進MDR的作用。為了探究NSUN2介導(dǎo)的耐藥機制，研究構(gòu)建了NSUN2基因敲除的ATC細胞系，并進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和MeRIP-seq分析。此外還通過RNA-seq測序和可變剪切(alternative splicing，AS)分析，研究NSUN2敲除后的整體變化。進一步通過糖蛋白染色、變性免疫沉淀泛素化、核質(zhì)分離和PCR等方法，探討了NSUN2/SRSF6/UAP1軸的潛在機制。最后在體外和體內(nèi)評估了小分子NSUN2抑制劑與抗癌藥物的協(xié)同效應(yīng)。
研究結(jié)果表明，NSUN2表達與ATC中的MDR顯著相關(guān)。NSUN2作為m5C的“writer”，ALYREF作為“reader”，它們共同作用于SRSF6 mRNA，誘導(dǎo)可變剪切重編程，并將UAP1基因的剪接形式從AGX1轉(zhuǎn)向AGX2。結(jié)果表明，AGX2增強了ABC轉(zhuǎn)運蛋白的N-糖基化，通過抑制泛素化介導(dǎo)的降解以穩(wěn)定這些蛋白。NSUN2抑制劑通過降低NSUN2酶活性并減少下游靶標(biāo)表達，為克服ATC中的MDR提供了一種新的、有前景的治療策略。
本研究揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC的MDR中的關(guān)鍵作用，并確定了NSUN2作為化療和靶向治療的協(xié)同靶點。
研究方法
生物信息學(xué)分析：通過分析ATC樣本的bulk RNA-seq測序數(shù)據(jù)，篩選與MDR相關(guān)的m5C修飾基因。
細胞實驗和分子機制研究：利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建NSUN2基因敲除（knockout）的ATC細胞系，通過RNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和MeRIP-seq分析等技術(shù)研究NSUN2的功能。
動物模型：構(gòu)建Nsun2基因敲除的自發(fā)性甲狀腺癌小鼠模型，評估NSUN2體內(nèi)對MDR影響。
藥物敏感性分析：通過IC50實驗和流式細胞術(shù)檢測NSUN2抑制劑與抗癌藥物的聯(lián)合效應(yīng)。
研究結(jié)果
（1）生物信息學(xué)分析揭示ATC中NSUN2和多藥耐藥性（MDR）之間的相關(guān)性
通過分析Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）數(shù)據(jù)庫中的藥物敏感性數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)NSUN2的表達與多種抗癌藥物（包括化療藥物和酪氨酸激酶抑制劑）的IC50值呈正相關(guān)。
利用GEO數(shù)據(jù)庫中的ATC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將患者分為高NSUN2表達組和低NSUN2表達組，發(fā)現(xiàn)高NSUN2表達與細胞分裂、有絲分裂、細胞周期等化療靶向過程相關(guān)。
scRNA-seq測序分析顯示，NSUN2在ATC細胞中的表達與多種化療藥物和TKI的耐藥性相關(guān)。
圖1：生物信息學(xué)分析揭示NSUN2與ATC中多藥耐藥性（MDR）的相關(guān)性。
A）來自CTRP數(shù)據(jù)庫的ATC患者基因表達與藥物敏感性的Spearman相關(guān)性分析。
B-C）高NSUN2表達組與低NSUN2表達組之間差異表達基因（DEGs）的富集通路總結(jié)。
D）ATC的scRNA-seq數(shù)據(jù)的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
E）散點圖顯示NSUN2陽性細胞與NSUN2陰性細胞的log2倍變化（log2FC）及其與每種藥物預(yù)測的IC50曲線下面積（AUC）值的相關(guān)性。
F）蝴蝶圖展示NSUN2表達、藥物敏感性與基因本體（GO）通路分析之間的相關(guān)性。
G）ATC的scRNA-seq數(shù)據(jù)的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
H）使用Beyondcell對GEO數(shù)據(jù)集樣本進行的單細胞藥物敏感性分析。
I）NSUN2表達與Beyondcell評分之間的相關(guān)性。
（2）ATC中NSUN2誘導(dǎo)的MDR取決于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性
在ATC細胞系中敲低或敲除NSUN2后，細胞對多種藥物的敏感性顯著增加，表明NSUN2表達與MDR密切相關(guān)。
通過構(gòu)建NSUN2催化活性突變體（C271A），發(fā)現(xiàn)只有野生型NSUN2能夠恢復(fù)m5C修飾活性和藥物耐受性，表明NSUN2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性是其誘導(dǎo)MDR的關(guān)鍵。
B）通過點雜交實驗檢測NSUN2基因敲除對Cal-62細胞mRNA轉(zhuǎn)錄組中m5C水平的影響。
C）通過比色法m5C定量實驗確認NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中m5C水平的變化。
D-F）通過細胞生長抑制實驗評估NSUN2基因敲除對Cal-62細胞對多柔比星（doxorubicin）、順鉑（cisplatin）和侖伐替尼（lenvatinib）敏感性的影響。
G）通過Western blot分析檢測Cal-62細胞經(jīng)不同處理后NSUN2蛋白的相對表達量。
H）通過點雜交實驗檢測經(jīng)載體處理后Cal-62細胞mRNA轉(zhuǎn)錄組中m5C豐度。
I）通過比色法m5C定量實驗確認經(jīng)處理后Cal-62細胞中m5C水平變化。
J-L）通過細胞生長抑制實驗評估經(jīng)不同載體轉(zhuǎn)染的Cal-62細胞的IC50值。
M）自發(fā)性ATC小鼠模型的構(gòu)建方案，包括靶向策略（左）和繁殖方案（右）。
N）小鼠基因分型結(jié)果，其中TPO-cre的DNA凝膠條帶大小為130/324bp，BrafV600E為185/307bp，Trp53flox/flox為290/370bp，Nsun2flox/flox為151/212bp。
O）在基因工程小鼠中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案。mATC（小鼠甲狀腺未分化癌）。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
Q）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
R）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
（3）在ATC中，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過靶向SRSF6驅(qū)動可變剪切重編程
蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，NSUN2敲除后，與RNA剪接相關(guān)的蛋白表達發(fā)生顯著變化，其中SRSF6蛋白表達顯著下調(diào)，而其mRNA水平不變。
MeRIP-seq和qPCR結(jié)果表明，NSUN2通過m5C修飾調(diào)節(jié)SRSF6 mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運，進而影響其蛋白表達。
通過突變SRSF6 mRNA上的m5C修飾位點，發(fā)現(xiàn)這些位點對SRSF6的核質(zhì)轉(zhuǎn)運至關(guān)重要。
B）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數(shù)據(jù)的GO富集分析。
C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后差異剪接基因的百分比剪接包含（ΔPSI）的火山圖。
D）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后顯著ΔPSI變化的小提琴圖。
E）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SF3A/B、U2AF核心復(fù)合體和hnRNP家族中DEG熱圖。
F）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數(shù)據(jù)中SRSF6蛋白水平的統(tǒng)計分析。
G）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后指示蛋白的Western blot分析。
H）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6基因座周圍的MeRIP-seq數(shù)據(jù)的IGV軌跡圖。
I）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR檢測。
J）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR分析。
K）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布qRT-PCR分析。
L）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
M）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的Western blot分析。
N）SRSF6中的典型m5C結(jié)合位點。頂部為m5C結(jié)合位點的motif序列；底部為SRSF6中鑒定的m5C位點。
O）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR定量。
P）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
（4）NSUN2通過增強ABC轉(zhuǎn)運蛋白的N-糖基化促進ATC中的MDR
轉(zhuǎn)錄組分析和KEGG通路分析顯示，NSUN2參與N-糖鏈生物合成過程。
通過糖蛋白染色和蛋白質(zhì)印跡分析，發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后，ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ABCC1和ABCG2）的N-糖基化水平降低，蛋白穩(wěn)定性下降。
流式細胞術(shù)檢測顯示，NSUN2敲除細胞對藥物攝取增加，表明藥物外排減少，耐藥性降低。
B-C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的基因集富集分析（GSEA）。
D）總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），NSUN2基因敲除后Cal-62細胞的糖蛋白染色結(jié)果（右）。
E-F）經(jīng)或未經(jīng)TM（tunicamycin）、SS（swainsonine）處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。細胞裂解樣本經(jīng)或未經(jīng)PNGase F處理。“G”表示N-糖基化，“DG”表示N-糖基化減少。
G）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）代表性免疫組化（IHC）圖像顯示35例ATC組織中NSUN2、ABCG2和ABCC1的表達情況。
I-J）采用卡方檢驗分析NSUN2與ABCG2或ABCC1表達之間的相關(guān)性。
K-L）NSUN2與ABCG2或ABCC1的IHC評分的相關(guān)性分析。
M-N）使用NetNglyc服務(wù)器預(yù)測的ABCG2和ABCC1的潛在N-糖基化天冬酰胺位點。
O-P）分別在轉(zhuǎn)染了N557Q、N388Q、N596Q或N71Q、N19Q、N310Q、N(71+310)Q突變質(zhì)粒的Cal-62細胞中，通過Western blot檢測ABCG2和ABCC1的表達情況。
Q-S）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內(nèi)積累情況的流式細胞儀分析。右側(cè)顯示平均熒光強度的定量結(jié)果。
（5）NSUN2通過N-糖基化增強ABC轉(zhuǎn)運蛋白的穩(wěn)定性
通過western blot 分析和泛素化實驗，發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后，ABCC1和ABCG2的泛素化水平增加，表明N-糖基化缺失導(dǎo)致這些蛋白更容易被降解。
使用蛋白酶體抑制劑MG132可以部分恢復(fù)ABCC1和ABCG2的蛋白水平，進一步證實了N-糖基化對蛋白穩(wěn)定性的影響。
B）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞經(jīng)不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進行Western blot分析。
C）經(jīng)TM和MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
D）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白水平進行定量分析。
E-F）經(jīng)TM和MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
G）NSUN2基因敲除且經(jīng)MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白強度進行定量分析。
I-J）NSUN2基因敲除且經(jīng)MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
K-L）在Cal-62細胞中表達的野生型（WT）或指示的ABCG2/ABCC1突變體經(jīng)125μg/mL環(huán)己酰亞胺（CHX）處理特定時間間隔后，通過Western blot進行分析。
M-N）使用ImageJ軟件對ABCG2或ABCC1的蛋白強度定量分析，并以β-Actin水平歸一化。
（6）NSUN2通過介導(dǎo)UAP1到SRSF6的可變剪切來促進N-糖基化
UAP1是N-糖基化反應(yīng)中UDP-GlcNAc合成的關(guān)鍵酶，其有兩種亞型（AGX1和AGX2）。
NSUN2敲除后，UAP1的剪接形式從AGX2轉(zhuǎn)變?yōu)锳GX1，導(dǎo)致N-糖基化活性降低。
通過過表達SRSF6，可以逆轉(zhuǎn)這一剪接變化，恢復(fù)N-糖基化水平和藥物耐受性。
B）Sashimi圖顯示NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中UAP1剪切事件的變化。
C）對照組與NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中UAP1剪切的RT-PCR分析。
D）自發(fā)性小鼠ATC腫瘤中UAP1的剪切事件的RT-PCR，有或沒有Nsun2基因敲除。
E）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中UAP1剪切事件的RT-PCR（上圖）。Western blot分析了SRSF6重建（下圖）。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左）。經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞糖蛋白染色（右）。
G）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H-J）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內(nèi)積累情況的流式細胞儀分析。右側(cè)顯示了平均熒光強度的定量結(jié)果。
K-M）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼敏感影響細胞生長抑制實驗。
N-P）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)影響的腫瘤生長曲線。
Q-S）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)影響腫瘤最終重量。
（7）作為m5C的“reader”， ALYREF可以鑒定SRSF6并將其從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)
通過RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉實驗，發(fā)現(xiàn)ALYREF能夠直接結(jié)合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)。
ALYREF的K171A突變體顯著降低對m5C -SRSF6結(jié)合能力，表明ALYREF是m5C修飾的“reader”。
ALYREF敲低或過表達可以調(diào)控SRSF6的細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運和蛋白表達，進而影響藥物耐受性。
C）熱圖顯示在NSUN2基因敲除或ALYREF、YBX1和SRSF2基因敲低的Cal-62細胞中與多柔比星和順鉑耐藥性相關(guān)的基因。
D）通過RIP-qPCR檢測ALYREF與Cal-62細胞中SRSF6的結(jié)合。
E）通過Western blot分析從SRSF6（m5C）下拉實驗中獲得的指示蛋白。
F）通過RIP-qPCR比較在經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中，野生型ALYREF（ALYREF-WT）和K171A突變型ALYREF（ALYREF-K171A）與SRSF6的結(jié)合。
G）通過RIP-qPCR評估NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結(jié)合。
H）通過RIP-qPCR評估經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結(jié)合。
I）通過qRT-PCR實驗評估ALYREF基因敲低的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
J）在過表達ALYREF或ALYREF-K171A突變體的Cal-62細胞中，SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
K）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
L-N）細胞生長抑制實驗評估指示載體處理對Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)的影響。
O）通過Western blot分析經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
P）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中ALYREF的免疫熒光染色（左側(cè)）以及核/質(zhì)ALYREF分布的定量分析（右側(cè)）。
Q）通過Western blot分析（左側(cè)）以及相應(yīng)的定量分析（右側(cè)），展示對照組和NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中核和質(zhì)ALYREF的水平，PARP1和TUBULIN分別作為核和質(zhì)標(biāo)記。
（8）小分子NSUN2抑制劑增強ATC中多藥敏感性
設(shè)計并合成小分子NSUN2抑制劑（NSUN2i），能夠顯著降低ATC細胞中的m5C水平。
NSUN2i處理后，SRSF6的核質(zhì)轉(zhuǎn)運受阻，UAP1剪接形式改變，N-糖基化水平降低，ABC轉(zhuǎn)運蛋白穩(wěn)定性下降。
體外實驗和動物模型實驗均顯示，NSUN2i與化療藥物或TKI聯(lián)合使用可以顯著增強藥物的抗腫瘤效果。
B）基于RT-qPCR的MeRIP檢測NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的m5C富集分析。
C）通過qRT-PCR實驗評估NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
D）通過Western blot分析NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
E）RT-PCR顯示經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中UAP1的剪接事件。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞的糖蛋白染色（右）。
G）通過Western blot分析經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中指示蛋白的水平。
H-J）通過流式細胞儀分析經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內(nèi)積累情況。右側(cè)顯示平均熒光強度的定量結(jié)果。
K-M）細胞生長抑制實驗評估NSUN2抑制劑與多柔比星、順鉑或侖伐替尼聯(lián)合使用對Cal-62細胞的影響。
N）展示在基因工程小鼠中NSUN2抑制劑、多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案示意圖。
O）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
Q）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
討論和局限性
本研究揭示了NSUN2通過m5C修飾調(diào)節(jié)SRSF6的細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運，進而影響UAP1剪切和N-糖基化水平，最終導(dǎo)致ATC耐藥性的機制。研究結(jié)果表明，NSUN2及其下游靶點是靶向ATC耐藥性的潛在治療靶點。
然而，NSUN2在正常細胞生理中也發(fā)揮重要作用，系統(tǒng)性抑制NSUN2可能會帶來安全性問題。此外，如何實現(xiàn)NSUN2抑制劑的腫瘤特異性遞送仍然是一個挑戰(zhàn)。
易小結(jié)
本研究通過m5C MeRIP-seq和RNA-seq等分析揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC耐藥性中的作用機制，為開發(fā)新的治療策略提供了理論依據(jù)。NSUN2抑制劑與現(xiàn)有抗癌藥物的聯(lián)合使用有望成為克服ATC耐藥性的新方法。未來的研究需要進一步評估NSUN2抑制劑的安全性和有效性，并探索其在其他腫瘤類型中的潛在應(yīng)用。
m5C MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究的m5C MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）主要用于揭示NSUN2在甲狀腺未分化癌（ATC）中的作用機制，主要表現(xiàn)在：
（1）鑒定m5C修飾的靶基因：通過MeRIP-seq技術(shù)能夠系統(tǒng)地分析NSUN2在ATC細胞中對mRNA的m5C修飾情況。研究發(fā)現(xiàn)，NSUN2能夠特異性地修飾SRSF6 mRNA上的m5C位點。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究NSUN2如何通過m5C修飾調(diào)控基因表達提供了直接證據(jù)。
（2）揭示m5C修飾的功能：MeRIP-seq分析顯示，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾能夠調(diào)節(jié)SRSF6 mRNA的細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運。具體來說，m5C修飾增強了SRSF6 mRNA從細胞核向細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運，從而促進了SRSF6蛋白的表達。這一過程對于ATC細胞的多藥耐藥性（MDR）至關(guān)重要。
（3）探索m5C修飾的調(diào)控機制：研究中通過MeRIP-seq結(jié)合其他實驗手段（如RNA下拉實驗和RIP-qPCR），揭示了ALYREF作為m5C修飾的“reader”，能夠鑒定并結(jié)合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)進一步完善了m5C修飾在基因表達調(diào)控中的分子機制。
（4）驗證m5C修飾的生物學(xué)意義：通過比較NSUN2敲除細胞與野生型細胞的MeRIP-seq數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后SRSF6 mRNA的m5C修飾水平顯著下降，同時SRSF6蛋白表達也受到抑制。這表明m5C修飾在維持SRSF6功能和ATC細胞耐藥性中發(fā)揮著重要作用。
參考文獻：
Hou X, Dong Q, Hao J, Liu M, Ning J, Tao M, Wang Z, Guo F, Huang D, Shi X, Gao M, Li D, Zheng X. NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis. Theranostics 2025; 15(7):2757-2777. doi:10.7150/thno.104713.
近日，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院鄭向前教授團隊以甲狀腺未分化癌（ATC）為研究對象，利用m5C MeRIP-seq等技術(shù)揭示了NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在ATC耐藥性中的作用機制，闡明了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC多藥耐藥性（Multidrug Resistance, MDR）中的關(guān)鍵作用，并提出通過小分子NSUN2抑制劑克服耐藥性的新策略。這一發(fā)現(xiàn)不僅為ATC的治療提供了新的靶點，也為理解RNA修飾在腫瘤耐藥性中的作用提供了重要依據(jù)。相關(guān)研究成果以《NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis》為題發(fā)表于《Theranostics》雜志。
標(biāo)題：NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis（NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸驅(qū)動可變剪切重編程并促進甲狀腺未分化癌的多藥耐藥性）
發(fā)表時間：2025-1-27
發(fā)表期刊：Theranostics
影響因子：IF 12.4/Q1
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、scRNA-seq、bulk RNA-seq（易基因金牌技術(shù)）
本研究通過對ATC樣本的bulk轉(zhuǎn)錄組（bulk RNA-seq）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)進行全面分析，以篩選與多藥耐藥性（MDR）相關(guān)的m5C修飾基因。隨后進行IC50實驗、流式細胞術(shù)分析，并利用Nsun2基因敲除的自發(fā)性甲狀腺癌（spontaneous tumorigenic ATC）小鼠模型，證明了NSUN2在ATC中促進MDR的作用。為了探究NSUN2介導(dǎo)的耐藥機制，研究構(gòu)建了NSUN2基因敲除的ATC細胞系，并進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和MeRIP-seq分析。此外還通過RNA-seq測序和可變剪切(alternative splicing，AS)分析，研究NSUN2敲除后的整體變化。進一步通過糖蛋白染色、變性免疫沉淀泛素化、核質(zhì)分離和PCR等方法，探討了NSUN2/SRSF6/UAP1軸的潛在機制。最后在體外和體內(nèi)評估了小分子NSUN2抑制劑與抗癌藥物的協(xié)同效應(yīng)。
研究結(jié)果表明，NSUN2表達與ATC中的MDR顯著相關(guān)。NSUN2作為m5C的“writer”，ALYREF作為“reader”，它們共同作用于SRSF6 mRNA，誘導(dǎo)可變剪切重編程，并將UAP1基因的剪接形式從AGX1轉(zhuǎn)向AGX2。結(jié)果表明，AGX2增強了ABC轉(zhuǎn)運蛋白的N-糖基化，通過抑制泛素化介導(dǎo)的降解以穩(wěn)定這些蛋白。NSUN2抑制劑通過降低NSUN2酶活性并減少下游靶標(biāo)表達，為克服ATC中的MDR提供了一種新的、有前景的治療策略。
本研究揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC的MDR中的關(guān)鍵作用，并確定了NSUN2作為化療和靶向治療的協(xié)同靶點。
研究摘要
研究方法
生物信息學(xué)分析：通過分析ATC樣本的bulk RNA-seq測序數(shù)據(jù)，篩選與MDR相關(guān)的m5C修飾基因。
細胞實驗和分子機制研究：利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建NSUN2基因敲除（knockout）的ATC細胞系，通過RNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和MeRIP-seq分析等技術(shù)研究NSUN2的功能。
動物模型：構(gòu)建Nsun2基因敲除的自發(fā)性甲狀腺癌小鼠模型，評估NSUN2體內(nèi)對MDR影響。
藥物敏感性分析：通過IC50實驗和流式細胞術(shù)檢測NSUN2抑制劑與抗癌藥物的聯(lián)合效應(yīng)。
研究結(jié)果
（1）生物信息學(xué)分析揭示ATC中NSUN2和多藥耐藥性（MDR）之間的相關(guān)性
通過分析Cancer Therapeutics Response Portal（CTRP）數(shù)據(jù)庫中的藥物敏感性數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)NSUN2的表達與多種抗癌藥物（包括化療藥物和酪氨酸激酶抑制劑）的IC50值呈正相關(guān)。
利用GEO數(shù)據(jù)庫中的ATC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將患者分為高NSUN2表達組和低NSUN2表達組，發(fā)現(xiàn)高NSUN2表達與細胞分裂、有絲分裂、細胞周期等化療靶向過程相關(guān)。
scRNA-seq測序分析顯示，NSUN2在ATC細胞中的表達與多種化療藥物和TKI的耐藥性相關(guān)。
圖1：生物信息學(xué)分析揭示NSUN2與ATC中多藥耐藥性（MDR）的相關(guān)性。
B-C）高NSUN2表達組與低NSUN2表達組之間差異表達基因（DEGs）的富集通路總結(jié)。
D）ATC的scRNA-seq數(shù)據(jù)的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
E）散點圖顯示NSUN2陽性細胞與NSUN2陰性細胞的log2倍變化（log2FC）及其與每種藥物預(yù)測的IC50曲線下面積（AUC）值的相關(guān)性。
F）蝴蝶圖展示NSUN2表達、藥物敏感性與基因本體（GO）通路分析之間的相關(guān)性。
G）ATC的scRNA-seq數(shù)據(jù)的tSNE圖，展示了鑒定出的細胞clusters（n=10）。
H）使用Beyondcell對GEO數(shù)據(jù)集樣本進行的單細胞藥物敏感性分析。
I）NSUN2表達與Beyondcell評分之間的相關(guān)性。
（2）ATC中NSUN2誘導(dǎo)的MDR取決于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性
在ATC細胞系中敲低或敲除NSUN2后，細胞對多種藥物的敏感性顯著增加，表明NSUN2表達與MDR密切相關(guān)。
通過構(gòu)建NSUN2催化活性突變體（C271A），發(fā)現(xiàn)只有野生型NSUN2能夠恢復(fù)m5C修飾活性和藥物耐受性，表明NSUN2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性是其誘導(dǎo)MDR的關(guān)鍵。
圖2：ATC中由NSUN2誘導(dǎo)的MDR依賴于其甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
A）通過Western blot分析檢測Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后的NSUN2蛋白表達情況。B）通過點雜交實驗檢測NSUN2基因敲除對Cal-62細胞mRNA轉(zhuǎn)錄組中m5C水平的影響。
C）通過比色法m5C定量實驗確認NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中m5C水平的變化。
D-F）通過細胞生長抑制實驗評估NSUN2基因敲除對Cal-62細胞對多柔比星（doxorubicin）、順鉑（cisplatin）和侖伐替尼（lenvatinib）敏感性的影響。
G）通過Western blot分析檢測Cal-62細胞經(jīng)不同處理后NSUN2蛋白的相對表達量。
H）通過點雜交實驗檢測經(jīng)載體處理后Cal-62細胞mRNA轉(zhuǎn)錄組中m5C豐度。
I）通過比色法m5C定量實驗確認經(jīng)處理后Cal-62細胞中m5C水平變化。
J-L）通過細胞生長抑制實驗評估經(jīng)不同載體轉(zhuǎn)染的Cal-62細胞的IC50值。
M）自發(fā)性ATC小鼠模型的構(gòu)建方案，包括靶向策略（左）和繁殖方案（右）。
N）小鼠基因分型結(jié)果，其中TPO-cre的DNA凝膠條帶大小為130/324bp，BrafV600E為185/307bp，Trp53flox/flox為290/370bp，Nsun2flox/flox為151/212bp。
O）在基因工程小鼠中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案。mATC（小鼠甲狀腺未分化癌）。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
Q）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
R）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
（3）在ATC中，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過靶向SRSF6驅(qū)動可變剪切重編程
蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，NSUN2敲除后，與RNA剪接相關(guān)的蛋白表達發(fā)生顯著變化，其中SRSF6蛋白表達顯著下調(diào)，而其mRNA水平不變。
MeRIP-seq和qPCR結(jié)果表明，NSUN2通過m5C修飾調(diào)節(jié)SRSF6 mRNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運，進而影響其蛋白表達。
通過突變SRSF6 mRNA上的m5C修飾位點，發(fā)現(xiàn)這些位點對SRSF6的核質(zhì)轉(zhuǎn)運至關(guān)重要。
圖3：ATC中，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾通過靶向SRSF6驅(qū)動可變剪切重編程。
A）通過TMT-MS檢測的Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后蛋白水平變化的火山圖。B）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數(shù)據(jù)的GO富集分析。
C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后差異剪接基因的百分比剪接包含（ΔPSI）的火山圖。
D）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后顯著ΔPSI變化的小提琴圖。
E）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SF3A/B、U2AF核心復(fù)合體和hnRNP家族中DEG熱圖。
F）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后TMT-MS數(shù)據(jù)中SRSF6蛋白水平的統(tǒng)計分析。
G）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后指示蛋白的Western blot分析。
H）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6基因座周圍的MeRIP-seq數(shù)據(jù)的IGV軌跡圖。
I）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR檢測。
J）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR分析。
K）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布qRT-PCR分析。
L）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
M）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的Western blot分析。
N）SRSF6中的典型m5C結(jié)合位點。頂部為m5C結(jié)合位點的motif序列；底部為SRSF6中鑒定的m5C位點。
O）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA中m5C富集的MeRIP-qPCR定量。
P）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
（4）NSUN2通過增強ABC轉(zhuǎn)運蛋白的N-糖基化促進ATC中的MDR
轉(zhuǎn)錄組分析和KEGG通路分析顯示，NSUN2參與N-糖鏈生物合成過程。
通過糖蛋白染色和蛋白質(zhì)印跡分析，發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后，ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ABCC1和ABCG2）的N-糖基化水平降低，蛋白穩(wěn)定性下降。
流式細胞術(shù)檢測顯示，NSUN2敲除細胞對藥物攝取增加，表明藥物外排減少，耐藥性降低。
圖4：NSUN2通過增強ABC轉(zhuǎn)運蛋白的N-糖基化促進ATC中的MDR。
A）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的GO富集分析。B-C）Cal-62細胞中NSUN2基因敲除后轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的基因集富集分析（GSEA）。
D）總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），NSUN2基因敲除后Cal-62細胞的糖蛋白染色結(jié)果（右）。
E-F）經(jīng)或未經(jīng)TM（tunicamycin）、SS（swainsonine）處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。細胞裂解樣本經(jīng)或未經(jīng)PNGase F處理。“G”表示N-糖基化，“DG”表示N-糖基化減少。
G）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）代表性免疫組化（IHC）圖像顯示35例ATC組織中NSUN2、ABCG2和ABCC1的表達情況。
I-J）采用卡方檢驗分析NSUN2與ABCG2或ABCC1表達之間的相關(guān)性。
K-L）NSUN2與ABCG2或ABCC1的IHC評分的相關(guān)性分析。
M-N）使用NetNglyc服務(wù)器預(yù)測的ABCG2和ABCC1的潛在N-糖基化天冬酰胺位點。
O-P）分別在轉(zhuǎn)染了N557Q、N388Q、N596Q或N71Q、N19Q、N310Q、N(71+310)Q突變質(zhì)粒的Cal-62細胞中，通過Western blot檢測ABCG2和ABCC1的表達情況。
Q-S）NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內(nèi)積累情況的流式細胞儀分析。右側(cè)顯示平均熒光強度的定量結(jié)果。
（5）NSUN2通過N-糖基化增強ABC轉(zhuǎn)運蛋白的穩(wěn)定性
通過western blot 分析和泛素化實驗，發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后，ABCC1和ABCG2的泛素化水平增加，表明N-糖基化缺失導(dǎo)致這些蛋白更容易被降解。
使用蛋白酶體抑制劑MG132可以部分恢復(fù)ABCC1和ABCG2的蛋白水平，進一步證實了N-糖基化對蛋白穩(wěn)定性的影響。
圖5：NSUN2通過N-糖基化增強ABC轉(zhuǎn)運蛋白的穩(wěn)定性。
A）Cal-62細胞經(jīng)TM或不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進行Western blot分析。B）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞經(jīng)不同濃度的MG132處理后，使用指定抗體進行Western blot分析。
C）經(jīng)TM和MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
D）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白水平進行定量分析。
E-F）經(jīng)TM和MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
G）NSUN2基因敲除且經(jīng)MG132處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H）使用ImageJ軟件對ABCC1和ABCG2蛋白強度進行定量分析。
I-J）NSUN2基因敲除且經(jīng)MG132處理的Cal-62細胞進行ABCC1或ABCG2免疫沉淀（IP），隨后使用抗泛素抗體進行Western blot分析。
K-L）在Cal-62細胞中表達的野生型（WT）或指示的ABCG2/ABCC1突變體經(jīng)125μg/mL環(huán)己酰亞胺（CHX）處理特定時間間隔后，通過Western blot進行分析。
M-N）使用ImageJ軟件對ABCG2或ABCC1的蛋白強度定量分析，并以β-Actin水平歸一化。
（6）NSUN2通過介導(dǎo)UAP1到SRSF6的可變剪切來促進N-糖基化
UAP1是N-糖基化反應(yīng)中UDP-GlcNAc合成的關(guān)鍵酶，其有兩種亞型（AGX1和AGX2）。
NSUN2敲除后，UAP1的剪接形式從AGX2轉(zhuǎn)變?yōu)锳GX1，導(dǎo)致N-糖基化活性降低。
通過過表達SRSF6，可以逆轉(zhuǎn)這一剪接變化，恢復(fù)N-糖基化水平和藥物耐受性。
圖6：NSUN2通過SRSF6介導(dǎo)UAP1的可變剪切促進N-糖基化。
A）UAP1促進UDP-GlcNAc的生物合成，UDP-GlcNAc是糖基化反應(yīng)中的關(guān)鍵供體，尤其在N-糖基化和O-GlcNAc修飾中。B）Sashimi圖顯示NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中UAP1剪切事件的變化。
C）對照組與NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中UAP1剪切的RT-PCR分析。
D）自發(fā)性小鼠ATC腫瘤中UAP1的剪切事件的RT-PCR，有或沒有Nsun2基因敲除。
E）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中UAP1剪切事件的RT-PCR（上圖）。Western blot分析了SRSF6重建（下圖）。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左）。經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞糖蛋白染色（右）。
G）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白水平的Western blot分析。
H-J）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內(nèi)積累情況的流式細胞儀分析。右側(cè)顯示了平均熒光強度的定量結(jié)果。
K-M）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼敏感影響細胞生長抑制實驗。
N-P）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)影響的腫瘤生長曲線。
Q-S）指示載體處理Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)影響腫瘤最終重量。
（7）作為m5C的“reader”， ALYREF可以鑒定SRSF6并將其從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)
通過RNA免疫沉淀（RIP）和RNA下拉實驗，發(fā)現(xiàn)ALYREF能夠直接結(jié)合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)。
ALYREF的K171A突變體顯著降低對m5C -SRSF6結(jié)合能力，表明ALYREF是m5C修飾的“reader”。
ALYREF敲低或過表達可以調(diào)控SRSF6的細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運和蛋白表達，進而影響藥物耐受性。
圖7：ALYREF作為m5C “reader”，能夠鑒定并介導(dǎo)SRSF6從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運。
A-B）GSEA分析表明ALYREF的表達與化療耐藥性相關(guān)。C）熱圖顯示在NSUN2基因敲除或ALYREF、YBX1和SRSF2基因敲低的Cal-62細胞中與多柔比星和順鉑耐藥性相關(guān)的基因。
D）通過RIP-qPCR檢測ALYREF與Cal-62細胞中SRSF6的結(jié)合。
E）通過Western blot分析從SRSF6（m5C）下拉實驗中獲得的指示蛋白。
F）通過RIP-qPCR比較在經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中，野生型ALYREF（ALYREF-WT）和K171A突變型ALYREF（ALYREF-K171A）與SRSF6的結(jié)合。
G）通過RIP-qPCR評估NSUN2基因敲除后Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結(jié)合。
H）通過RIP-qPCR評估經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中ALYREF與SRSF6 mRNA的結(jié)合。
I）通過qRT-PCR實驗評估ALYREF基因敲低的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
J）在過表達ALYREF或ALYREF-K171A突變體的Cal-62細胞中，SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
K）經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
L-N）細胞生長抑制實驗評估指示載體處理對Cal-62細胞對多柔比星、順鉑和侖伐替尼反應(yīng)的影響。
O）通過Western blot分析經(jīng)指示載體處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
P）NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中ALYREF的免疫熒光染色（左側(cè)）以及核/質(zhì)ALYREF分布的定量分析（右側(cè)）。
Q）通過Western blot分析（左側(cè)）以及相應(yīng)的定量分析（右側(cè)），展示對照組和NSUN2基因敲除的Cal-62細胞中核和質(zhì)ALYREF的水平，PARP1和TUBULIN分別作為核和質(zhì)標(biāo)記。
（8）小分子NSUN2抑制劑增強ATC中多藥敏感性
設(shè)計并合成小分子NSUN2抑制劑（NSUN2i），能夠顯著降低ATC細胞中的m5C水平。
NSUN2i處理后，SRSF6的核質(zhì)轉(zhuǎn)運受阻，UAP1剪接形式改變，N-糖基化水平降低，ABC轉(zhuǎn)運蛋白穩(wěn)定性下降。
體外實驗和動物模型實驗均顯示，NSUN2i與化療藥物或TKI聯(lián)合使用可以顯著增強藥物的抗腫瘤效果。
圖8：小分子NSUN2抑制劑增強ATC對多藥的敏感性。
A）通過點雜交實驗評估NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中mRNA的m5C水平。B）基于RT-qPCR的MeRIP檢測NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的m5C富集分析。
C）通過qRT-PCR實驗評估NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中SRSF6 mRNA的核質(zhì)分布。
D）通過Western blot分析NSUN2基因敲除的經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中指示蛋白的水平。
E）RT-PCR顯示經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中UAP1的剪接事件。
F）檢測總蛋白的考馬斯亮藍染色（左），經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞的糖蛋白染色（右）。
G）通過Western blot分析經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞和ACT-1細胞中指示蛋白的水平。
H-J）通過流式細胞儀分析經(jīng)或未經(jīng)NSUN2抑制劑處理的Cal-62細胞中多柔比星、順鉑和侖伐替尼的細胞內(nèi)積累情況。右側(cè)顯示平均熒光強度的定量結(jié)果。
K-M）細胞生長抑制實驗評估NSUN2抑制劑與多柔比星、順鉑或侖伐替尼聯(lián)合使用對Cal-62細胞的影響。
N）展示在基因工程小鼠中NSUN2抑制劑、多柔比星、順鉑和侖伐替尼的給藥方案示意圖。
O）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤重量。
P）散點圖顯示各組小鼠的最終腫瘤體積。
Q）顯示各組ATC小鼠的生存曲線。
圖9：NSUN2在ATC多藥耐藥中的功能和機制示意圖模型。
討論和局限性
本研究揭示了NSUN2通過m5C修飾調(diào)節(jié)SRSF6的細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運，進而影響UAP1剪切和N-糖基化水平，最終導(dǎo)致ATC耐藥性的機制。研究結(jié)果表明，NSUN2及其下游靶點是靶向ATC耐藥性的潛在治療靶點。
然而，NSUN2在正常細胞生理中也發(fā)揮重要作用，系統(tǒng)性抑制NSUN2可能會帶來安全性問題。此外，如何實現(xiàn)NSUN2抑制劑的腫瘤特異性遞送仍然是一個挑戰(zhàn)。
易小結(jié)
本研究通過m5C MeRIP-seq和RNA-seq等分析揭示了NSUN2/SRSF6/UAP1信號軸在ATC耐藥性中的作用機制，為開發(fā)新的治療策略提供了理論依據(jù)。NSUN2抑制劑與現(xiàn)有抗癌藥物的聯(lián)合使用有望成為克服ATC耐藥性的新方法。未來的研究需要進一步評估NSUN2抑制劑的安全性和有效性，并探索其在其他腫瘤類型中的潛在應(yīng)用。
m5C MeRIP-seq在本研究中的重要作用
本研究的m5C MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）主要用于揭示NSUN2在甲狀腺未分化癌（ATC）中的作用機制，主要表現(xiàn)在：
（1）鑒定m5C修飾的靶基因：通過MeRIP-seq技術(shù)能夠系統(tǒng)地分析NSUN2在ATC細胞中對mRNA的m5C修飾情況。研究發(fā)現(xiàn)，NSUN2能夠特異性地修飾SRSF6 mRNA上的m5C位點。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)研究NSUN2如何通過m5C修飾調(diào)控基因表達提供了直接證據(jù)。
（2）揭示m5C修飾的功能：MeRIP-seq分析顯示，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾能夠調(diào)節(jié)SRSF6 mRNA的細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運。具體來說，m5C修飾增強了SRSF6 mRNA從細胞核向細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運，從而促進了SRSF6蛋白的表達。這一過程對于ATC細胞的多藥耐藥性（MDR）至關(guān)重要。
（3）探索m5C修飾的調(diào)控機制：研究中通過MeRIP-seq結(jié)合其他實驗手段（如RNA下拉實驗和RIP-qPCR），揭示了ALYREF作為m5C修飾的“reader”，能夠鑒定并結(jié)合m5C修飾的SRSF6 mRNA，并將其從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)進一步完善了m5C修飾在基因表達調(diào)控中的分子機制。
（4）驗證m5C修飾的生物學(xué)意義：通過比較NSUN2敲除細胞與野生型細胞的MeRIP-seq數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)NSUN2敲除后SRSF6 mRNA的m5C修飾水平顯著下降，同時SRSF6蛋白表達也受到抑制。這表明m5C修飾在維持SRSF6功能和ATC細胞耐藥性中發(fā)揮著重要作用。
參考文獻：
Hou X, Dong Q, Hao J, Liu M, Ning J, Tao M, Wang Z, Guo F, Huang D, Shi X, Gao M, Li D, Zheng X. NSUN2-mediated m5C modification drives alternative splicing reprogramming and promotes multidrug resistance in anaplastic thyroid cancer through the NSUN2/SRSF6/UAP1 signaling axis. Theranostics 2025; 15(7):2757-2777. doi:10.7150/thno.104713.
標(biāo)簽：
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