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然而，RPT方法存在諸多局限性。它容易受到兔子飼養條件、種類差異等因素的干擾，無法檢測特定物質，而且在醫療器械植入時容易出現局部反應。此外，動物試驗結果不能直接應用于人體，但由于其能檢測未定性熱原，至今仍被視為熱原檢測的“黃金標準”。不過，這一方法在歐洲每年用于腸外藥物試驗的兔子超過10,000只，給動物帶來了極大的壓力。

二、尋求替代：從3R戰略到新方法的探索
鑒于RPT方法的局限性，自1986年起，歐洲藥典委員會積極實施3R戰略，致力于開發替代方法。經過多年努力，2021年歐洲藥典委員會決定在五年內用先進的體外檢測（如MAT）完全取代RPT。2024年6月，該委員會正式批準從所有條款中刪除家兔檢測，修訂文本將于2025年7月1日生效。

在RPT方法逐步被取代的過程中，鱟變形細胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate，LAL）檢測法成為熱原檢測的重要替代方法。該方法利用鱟血變形細胞提取物通過凝血技術檢測內毒素，靈敏度高達0.005EU/ml，遠高于兔熱原試驗（0.5-3EU/ml）。隨著不斷改進，從凝膠凝塊檢測法發展到濁度測定法和顯色鱟試劑檢測法，靈敏度可達0.001EU/ml。

但LAL檢測法也存在不少問題。它易受多種無害物質影響而出現假陽性，只能檢測細菌內毒素，無法檢測非內毒素致熱原或其他污染物的增效作用，而且獲取鱟血淋巴會對馬蹄蟹種群產生影響。因此，人們仍在不斷尋找更為理想的熱原檢測方法。

三、新型檢測方法：重組試劑與單核細胞活化試驗
2024年11月，《美國藥典-國家處方集》（USP-NF）正式納入了第86章“使用重組試劑的細菌內毒素測試”，并宣布該章節于2025年5月起正式生效。其中，PyroSmartNextGen®重組鱟試劑作為全球首款完整的重組級聯試劑（rCR），完全模擬了天然鱟試劑LAL的酶聯反應，剔除了容易引起假陽性的G因子，且不依賴鱟血，符合可持續發展的目標。

盡管LAL檢測法在靈敏度等方面有所提升，但它更像是RPT的補充而非替代。因為其與哺乳動物的熱原反應機制存在差異，只能評估液體樣本中的細菌內毒素，使用的系統也與哺乳動物系統不同，可能無法反映樣本的真實熱原潛力，所以和RPT一樣，LAL試驗也不能完全預測人體對試驗物質的反應。

隨著對發熱反應分子機制研究的深入，單核細胞活化試驗（Monocyte-Activation Test，MAT）作為一種體外熱原檢測方法逐漸嶄露頭角。MAT利用人體全血與熱原接觸后產生的促炎細胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF）來評估熱原污染，能模擬人體先天免疫系統反應。它不僅能檢測各種熱原污染物，包括未定性熱原和非內毒素，還能檢測塑料、金屬、植入物和醫療器械等固體材料。

MAT于2010年和2012年分別被納入《歐洲藥典》和《美國藥典》。該方法有多種變體，提供不同的人類單核細胞來源，如全血、分離的原始單核細胞（如PBMC）或單核細胞系。雖然相比rCR檢測法，MAT存在供體變異導致靈敏度偏差和檢測范圍較窄的問題，但可以對熱原進行定量，且使用全血及其成分更可能再現體內反應。

盡管新鮮全血的可獲得性有限，但可以通過低溫保存的血液或白細胞介素(PBMC)來解決。驗證研究表明，全血含有對熱原反應的必要成分，且熱原刺激的分子機制已成功應用于體外模型中。

四、總結：綜合選擇，保障用藥安全
在藥品生產過程中，熱原檢測對于保證腸外藥品、醫療器械、生物制劑等直接或間接進入血液物質的質量與安全意義重大。家兔熱原試驗（RPT）、鱟變形細胞裂解物（LAL）試驗和單核細胞活化試驗（MAT）各有優缺點，在實際應用中，需要根據具體情況合理選擇檢測方法，以最大程度保障患者用藥安全。