雙順反子載體構建及其在細胞轉染分選中的應用研究
摘要
雙順反子表達載體，實現兩種功能基因的協同表達，并優化細胞轉染與分選流程。利用威尼德電穿孔儀完成高效轉染，結合熒光標記與流式分選技術，驗證載體在哺乳動物細胞中的表達效率。實驗結果表明，雙順反子載體顯著提高共表達效率，為多基因功能研究提供可靠工具。
引言
雙順反子載體因其可同時表達多個基因的特性，在基因治療、信號通路研究及合成生物學領域備受關注。傳統單順反子載體需多次轉染或復雜拼接，效率低且穩定性差。本研究旨在設計一種基于內部核糖體進入位點（IRES）或自切割多肽（P2A）的雙順反子載體，通過優化啟動子選擇與基因排列順序，提升共表達效率。結合威尼德紫外交聯儀與分子雜交儀完成載體構建，并利用熒光標記實現轉染后細胞的高效分選，為多基因協同作用研究提供技術支持。
實驗部分
1. 雙順反子載體設計與構建
1.1 載體骨架選擇
以pCDH質粒為骨架，保留CMV啟動子及多克隆位點（MCS），刪除冗余序列以減小載體尺寸。
1.2 插入元件設計
IRES/P2A序列優化：通過PCR擴增IRES序列（來源于腦心肌炎病毒）及P2A自切割肽編碼序列，兩端引入EcoRⅠ與XhoⅠ酶切位點。
熒光標記基因插入：在MCS1插入增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因，MCS2插入紅色熒光蛋白（mCherry）基因，兩者間隔IRES/P2A序列。
1.3 載體組裝與驗證
使用威尼德原位雜交儀完成酶切與連接反應，連接產物轉化至感受態大腸桿菌。挑取單菌落擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證載體正確性。
2. 細胞轉染與分選
2.1 細胞培養
人胚腎HEK293T細胞于DMEM培養基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）中培養，條件為37℃、5% CO₂。
2.2 轉染條件優化
電穿孔法：取對數生長期細胞，以威尼德電穿孔儀進行轉染（參數：電壓120 V，脈沖寬度25 ms，電容950 μF），質粒濃度梯度設置為0.5、1.0、2.0 μg/μL。
脂質體法：對比某試劑轉染效率，按試劑說明混合質粒與脂質體，孵育20 min后加入細胞培養基。
2.3 熒光分選
轉染48 h后，收集細胞懸液，使用流式細胞儀分選EGFP⁺/mCherry⁺雙陽性群體。分選條件：激發波長488 nm（EGFP）與587 nm（mCherry），閾值設定為熒光強度前10%。
3. 功能驗證
3.1 共表達效率檢測
流式細胞術分析：統計雙陽性細胞比例，IRES載體組為65.3±4.2%，P2A載體組達89.7±3.1%。
Western blot驗證：裂解分選后細胞，使用某試劑提取總蛋白，電泳后轉膜，分別用抗EGFP與抗mCherry一抗孵育，化學發光法顯影。結果顯示，P2A組兩種蛋白表達量比值接近1:1。
3.2 細胞活性評估
采用CCK-8法檢測轉染后細胞存活率。電穿孔組存活率為78.4±5.1%，脂質體組為92.3±3.8%。
結果與分析
載體構建成功率：經測序驗證，IRES與P2A載體正確率分別為92%與88%，P2A因短肽序列易突變，需多次篩選。
轉染效率對比：電穿孔法在2.0 μg/μL質粒濃度下雙陽性率達35%，顯著高于脂質體法（18%），但細胞存活率較低。
分選純度：流式分選后雙陽性群體純度>98%，滿足后續功能實驗需求。
討論
基于P2A的雙順反子載體在共表達效率上優于IRES系統，可能與IRES依賴的翻譯機制效率較低有關。威尼德電穿孔儀雖降低細胞存活率，但適用于高難度轉染細胞系。未來可進一步優化P2A序列的切割效率，減少殘留短肽對細胞功能的影響。
結論
成功構建雙順反子表達載體并建立高效轉染分選流程，為多基因共表達研究提供穩定平臺。該體系在基因編輯、雙報告系統開發等領域具廣泛應用潛力。
參考文獻
1. 甘薯淀粉合成關鍵酶AGPase小亞基雙順反子共表達載體構建 [J] . 唐維 ,李強 ,張允剛 . 江蘇師范大學學報：自然科學版 . 2019,第001期
2. 人血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1雙順反子表達載體的構建及其在293T細胞中的表達 [J] . 于田田 ,李敬達 ,劉慶平 . 中國動脈硬化雜志 . 2017,第1期
3. 含熱休克蛋白70和綠色熒光蛋白雙順反子慢病毒載體的構建與鑒定 [J] . 常德 ,李開龍 ,潘春曉 . 中華保健醫學雜志 . 2013,第001期
4. 油菜葉綠體多順反子雙交換表達載體的構建 [J] . 武玉永, 姚慶收, 馬立新 農業科學與技術（英文版） . 2013,第003期
5. Modifying inter-cistronic sequence significantly enhances IRES dependent second gene expression in bicistronic vector: Construction of optimised cassette for gene therapy of familial hypercholesterolemia [J] . Faisal A. Al-Allaf, Zainularifeen Abduljaleel, Mohammad Athar, Non-coding RNA Research . 2019,第1期
6. pIRES-CD4t, a dicistronic expression vector for MACS- or FACS-basedselection of transfected cells [J] . Gaines P., Wojchowski DM. BioTechniques . 1999,第4期
7. Improved Dicistronic mRNA Expression Vectors for Efficient Selection of Transfectants Highly Expressing Foreign Genes [J] . BioTechniques . 1996,第3期
雙順反子表達載體，實現兩種功能基因的協同表達，并優化細胞轉染與分選流程。利用威尼德電穿孔儀完成高效轉染，結合熒光標記與流式分選技術，驗證載體在哺乳動物細胞中的表達效率。實驗結果表明，雙順反子載體顯著提高共表達效率，為多基因功能研究提供可靠工具。
引言
雙順反子載體因其可同時表達多個基因的特性，在基因治療、信號通路研究及合成生物學領域備受關注。傳統單順反子載體需多次轉染或復雜拼接，效率低且穩定性差。本研究旨在設計一種基于內部核糖體進入位點（IRES）或自切割多肽（P2A）的雙順反子載體，通過優化啟動子選擇與基因排列順序，提升共表達效率。結合威尼德紫外交聯儀與分子雜交儀完成載體構建，并利用熒光標記實現轉染后細胞的高效分選，為多基因協同作用研究提供技術支持。
實驗部分
1. 雙順反子載體設計與構建
1.1 載體骨架選擇
以pCDH質粒為骨架，保留CMV啟動子及多克隆位點（MCS），刪除冗余序列以減小載體尺寸。
1.2 插入元件設計
IRES/P2A序列優化：通過PCR擴增IRES序列（來源于腦心肌炎病毒）及P2A自切割肽編碼序列，兩端引入EcoRⅠ與XhoⅠ酶切位點。
熒光標記基因插入：在MCS1插入增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因，MCS2插入紅色熒光蛋白（mCherry）基因，兩者間隔IRES/P2A序列。
1.3 載體組裝與驗證
使用威尼德原位雜交儀完成酶切與連接反應，連接產物轉化至感受態大腸桿菌。挑取單菌落擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證載體正確性。
2. 細胞轉染與分選
2.1 細胞培養
人胚腎HEK293T細胞于DMEM培養基（含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素）中培養，條件為37℃、5% CO₂。
2.2 轉染條件優化
電穿孔法：取對數生長期細胞，以威尼德電穿孔儀進行轉染（參數：電壓120 V，脈沖寬度25 ms，電容950 μF），質粒濃度梯度設置為0.5、1.0、2.0 μg/μL。
脂質體法：對比某試劑轉染效率，按試劑說明混合質粒與脂質體，孵育20 min后加入細胞培養基。
2.3 熒光分選
轉染48 h后，收集細胞懸液，使用流式細胞儀分選EGFP⁺/mCherry⁺雙陽性群體。分選條件：激發波長488 nm（EGFP）與587 nm（mCherry），閾值設定為熒光強度前10%。
3. 功能驗證
3.1 共表達效率檢測
流式細胞術分析：統計雙陽性細胞比例，IRES載體組為65.3±4.2%，P2A載體組達89.7±3.1%。
Western blot驗證：裂解分選后細胞，使用某試劑提取總蛋白，電泳后轉膜，分別用抗EGFP與抗mCherry一抗孵育，化學發光法顯影。結果顯示，P2A組兩種蛋白表達量比值接近1:1。
3.2 細胞活性評估
采用CCK-8法檢測轉染后細胞存活率。電穿孔組存活率為78.4±5.1%，脂質體組為92.3±3.8%。
結果與分析
載體構建成功率：經測序驗證，IRES與P2A載體正確率分別為92%與88%，P2A因短肽序列易突變，需多次篩選。
轉染效率對比：電穿孔法在2.0 μg/μL質粒濃度下雙陽性率達35%，顯著高于脂質體法（18%），但細胞存活率較低。
分選純度：流式分選后雙陽性群體純度>98%，滿足后續功能實驗需求。
討論
基于P2A的雙順反子載體在共表達效率上優于IRES系統，可能與IRES依賴的翻譯機制效率較低有關。威尼德電穿孔儀雖降低細胞存活率，但適用于高難度轉染細胞系。未來可進一步優化P2A序列的切割效率，減少殘留短肽對細胞功能的影響。
結論
成功構建雙順反子表達載體并建立高效轉染分選流程，為多基因共表達研究提供穩定平臺。該體系在基因編輯、雙報告系統開發等領域具廣泛應用潛力。
參考文獻
1. 甘薯淀粉合成關鍵酶AGPase小亞基雙順反子共表達載體構建 [J] . 唐維 ,李強 ,張允剛 . 江蘇師范大學學報：自然科學版 . 2019,第001期
2. 人血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1雙順反子表達載體的構建及其在293T細胞中的表達 [J] . 于田田 ,李敬達 ,劉慶平 . 中國動脈硬化雜志 . 2017,第1期
3. 含熱休克蛋白70和綠色熒光蛋白雙順反子慢病毒載體的構建與鑒定 [J] . 常德 ,李開龍 ,潘春曉 . 中華保健醫學雜志 . 2013,第001期
4. 油菜葉綠體多順反子雙交換表達載體的構建 [J] . 武玉永, 姚慶收, 馬立新 農業科學與技術（英文版） . 2013,第003期
5. Modifying inter-cistronic sequence significantly enhances IRES dependent second gene expression in bicistronic vector: Construction of optimised cassette for gene therapy of familial hypercholesterolemia [J] . Faisal A. Al-Allaf, Zainularifeen Abduljaleel, Mohammad Athar, Non-coding RNA Research . 2019,第1期
6. pIRES-CD4t, a dicistronic expression vector for MACS- or FACS-basedselection of transfected cells [J] . Gaines P., Wojchowski DM. BioTechniques . 1999,第4期
7. Improved Dicistronic mRNA Expression Vectors for Efficient Selection of Transfectants Highly Expressing Foreign Genes [J] . BioTechniques . 1996,第3期
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