摘要
原代神經(jīng)元培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染技術(shù)，以提高神經(jīng)元存活率和轉(zhuǎn)染效率。通過改進(jìn)培養(yǎng)條件、優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，并采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，成功建立了高效的原代神經(jīng)元轉(zhuǎn)染體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的方法顯著提高了神經(jīng)元存活率和轉(zhuǎn)染效率，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了可靠的技術(shù)支持。
引言
原代神經(jīng)元培養(yǎng)是神經(jīng)科學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，而高效的轉(zhuǎn)染技術(shù)則是研究神經(jīng)元基因功能的關(guān)鍵。然而，由于神經(jīng)元的高度分化特性，傳統(tǒng)的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染方法往往存在效率低下、細(xì)胞存活率不理想等問題。近年來，隨著神經(jīng)科學(xué)研究的深入，對(duì)原代神經(jīng)元培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染技術(shù)的要求日益提高。本研究旨在通過系統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)染參數(shù)，建立一套高效、穩(wěn)定的原代神經(jīng)元培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染體系，為神經(jīng)科學(xué)研究提供可靠的技術(shù)支持。
一、材料與方法
本研究采用新生SD大鼠的海馬組織作為原代神經(jīng)元來源。實(shí)驗(yàn)所需試劑包括某試劑神經(jīng)元培養(yǎng)基、某試劑胎牛血清、某試劑胰蛋白酶等。主要儀器設(shè)備包括威尼德電穿孔儀、威尼德紫外交聯(lián)儀和威尼德分子雜交儀。
原代神經(jīng)元分離與培養(yǎng)過程如下：取新生SD大鼠海馬組織，用某試劑胰蛋白酶消化后，以某試劑神經(jīng)元培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞在37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一半培養(yǎng)基。
神經(jīng)元轉(zhuǎn)染優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行。將培養(yǎng)7天的神經(jīng)元消化后重懸于電轉(zhuǎn)緩沖液中，加入質(zhì)粒DNA，使用威尼德電穿孔儀在不同電壓和脈沖時(shí)間條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞立即接種于預(yù)溫的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察轉(zhuǎn)染效率。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，我們成功建立了穩(wěn)定的原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系。神經(jīng)元在培養(yǎng)7天后形成密集的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，細(xì)胞存活率達(dá)到90%以上。免疫熒光染色顯示，培養(yǎng)細(xì)胞中超過95%為神經(jīng)元特異性標(biāo)記物陽性，表明獲得了高純度的原代神經(jīng)元。
在轉(zhuǎn)染優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，我們系統(tǒng)比較了不同電壓和脈沖時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用威尼德電穿孔儀在電壓200 V、脈沖時(shí)間10 ms的條件下，可獲得最佳的轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到60%以上，同時(shí)保持80%以上的細(xì)胞存活率。與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法相比，電穿孔法顯著提高了轉(zhuǎn)染效率，且對(duì)細(xì)胞活性的影響較小。
三、討論
本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)染參數(shù)，成功建立了高效的原代神經(jīng)元培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染體系。與以往研究相比，我們的方法在細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)染效率方面均有顯著提高。這主要?dú)w功于以下幾個(gè)方面的改進(jìn)：首先，優(yōu)化了神經(jīng)元分離和培養(yǎng)條件，提高了細(xì)胞存活率和純度；其次，采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過系統(tǒng)優(yōu)化電轉(zhuǎn)參數(shù)，在保證細(xì)胞活性的同時(shí)大幅提高了轉(zhuǎn)染效率。
然而，本研究仍存在一些局限性。例如，實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)海馬神經(jīng)元進(jìn)行了優(yōu)化，其他腦區(qū)神經(jīng)元的適用性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，雖然電穿孔法顯著提高了轉(zhuǎn)染效率，但對(duì)于某些特殊實(shí)驗(yàn)需求，如長(zhǎng)期基因表達(dá)觀察，仍需探索更溫和的轉(zhuǎn)染方法。
四、結(jié)論
本研究成功優(yōu)化了原代神經(jīng)元培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立了高效、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系。通過改進(jìn)培養(yǎng)條件和優(yōu)化威尼德電穿孔儀參數(shù)，顯著提高了神經(jīng)元存活率和轉(zhuǎn)染效率。這一優(yōu)化方案為神經(jīng)科學(xué)研究提供了可靠的技術(shù)支持，有望在神經(jīng)元基因功能研究、神經(jīng)疾病模型構(gòu)建等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。未來研究可進(jìn)一步探索該技術(shù)在不同類型神經(jīng)元中的應(yīng)用，并開發(fā)更高效的轉(zhuǎn)染方法，以滿足神經(jīng)科學(xué)研究的多樣化需求。
參考文獻(xiàn)
1. 郭琴,毛萌,羅小麗,等.神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)[J].華西醫(yī)學(xué).2007,(3).DOI:10.3969/j.issn.1002-0179.2007.03.062 .
2. 王秀力,陳東,劉佳梅.NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞向神經(jīng)元的分化[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）.2007,(5).DOI:10.3969/j.issn.1671-587X.2007.05.013 .
3. 馬巍,吳學(xué)元,陳煒,等.慢病毒轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤基因治療的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué).2006,(6).DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2006.06.050 .
4. 張艷君,賈秀紅,李建廠,等.病毒及非病毒載體對(duì)U937單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2013,(2).DOI:10.3969/j.issn.0253-3626.2013.02.013 .
5. 尹金寶,常全忠,韓宇東.新生大鼠離體海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法及鑒定[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志.2012,(6).
6. Miroslav N, Nenov,Filippo, Tempia,Larry, Denner,等.Impaired firing properties of dentate granule neurons in an Alzheimer's disease animal model are rescued by PPARγ agonism.[J].Journal of Neurophysiology.2015.1131712-26.
7. W Michael, Zawada,Robert E, Mrak,JoAnn, Biedermann,等.Loss of angiotensin II receptor expression in dopamine neurons in Parkinson's disease correlates with pathological progression and is accompanied by increases in Nox4- and 8-OH guanosine-related nucleic acid oxidation and caspase-3 activation.[J].Acta neuropathologica communications.2015.39.
8. Ti-Fei, Yuan,Yu-Xiang, Liang,Kwok-Fai, So.Occurrence of new neurons in the piriform cortex.[J].Frontiers in Neuroanatomy.2014.8167.
9. D'Alessandro R,Meldolesi J.In PC12 cells, expression of neurosecretion and neurite outgrowth are governed by the transcription repressor REST/NRSF.[J].Cellular & Molecular Neurobiology.2010,30(8).
10. Xu K,Yang Y,Zheng X,等.Transport of autophagosomes in neurites of PC12 cells during serum deprivation.[J].Autophagy.2008,4(2).